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P3wnt3abutnotwnt11supportsself-renewalofembryonicstemcells[4]摘要：MEF饲养层或添加LIF的培养液可以维持ES细胞的自我更新并不分化，WNT蛋白在这方面的作用还不清楚。目前的研究中发现，一种通过表达wnt3a的L细胞制备的条件培养基可以替代饲养层细胞以及含LIF的培养液，可以维持ES细胞的增殖并可抑制其分化。相反，另一种由表达wnt11的NIH3T3细胞制备的培养基不能发挥同样的作用。将碱性磷酸酶染色以及克隆集落的形态作为检测ES细胞是否分化的标准。在wnt3a条件培养下的ES细胞经过冻存和解冻后仍然具有LIF依赖的ES的特性。只是wnt3a不能维持较长时间。因此，在wnt3a条件培养基中添加其他因子有利于ES细胞的自我更新。能否在体外获得类胚体作为检测ES多能性的方法。添加PD98059，MEK特异性抑制剂，能够促进依赖wnt3a的ES细胞的增殖并抑制其分化，而SB230580，MAPK的抑制剂，却不能，充分说明MEK信号通路在依赖wnt3a的ES细胞增殖与分化中的作用。总之，我们的结果显示wnt3a可以有效的促进ES细胞的自我更新并抑制其分化，而wnt11不能。self-renewal(proliferationwithoutdifferentiation)培养液中的生长因子可以促使ES细胞自我更新或分化，因此阐明促进ES细胞自我更新、多能性维持以及分化的生长因子和细胞因子对于ES细胞在再生医学领域中的应用是非常有益的。本研究的目的在于表征wnt3a和wnt11这两种wnt蛋白对于ES细胞自我更新的直接影响，并比较了由分别表达wnt3a、wnt11蛋白的细胞制备的条件培养基的效果。在由表达wnt3a细胞制备的条件培养基中培养的ES细胞，通过类胚体来检测其多能性，并通过体外向心肌细胞的分化评价其多能性。讨论：1.目前的实验结果显示利用表达wnt3a的细胞制备的条件培养基可以维持ES细胞的自我更新以及保持多能性的状态。2.表达wnt11的细胞制备的条件培养基不具有同样的作用。3，我们同时发现wnt3a条件培养基可以较长时间的维持ES细胞的生长而不分化，这与之前使用的饲养层细胞或者含LIF的培养基效果类似。4，此外，通过wnt3a条件培养基培养的ES细胞能够形成具有三胚层的类胚体，因此可以证明ES细胞的多能性。5，MEK抑制剂PD98059可以促进ES细胞的自我更新。不论是特殊的细胞因子还是生长因子，它们对于ES细胞的自我更新以及多能性状态的维持都是通过一个主要的模式来发挥作用的。尽管近来的研究显示，移植的依赖于STO饲养层或LIF的ES细胞可以分化形成心脏类型细胞，然而，在心肌梗死后，细胞分化的种类有限，不足以支持心脏的再生。也许wnt3a条件培养基对于CGR8ES细胞的自我更新以及多能性的调控会有所不同，从而使得培养的ES细胞可以分化成心脏或其它多种类型的细胞。Wnt蛋白是cysteine-richlipid-modifiedglycolproteins富含半胱氨酸脂质修饰的糖蛋白，在胚胎发育，细胞凋亡，轴极性的建立，癌症，细胞增殖，自我更新以及细胞分化中具有重要的作用【13】【14】。Wnt3a促进造血干细胞的自我更新【15】，chickembryo中神经管表达的wnt3a或wnt1阻碍心脏发生【14】，wnt11促进心脏的发生，在卵黄囊和胎儿肝脏中发现了wnt5a和wnt10b的表达【13】【14】。在本研究中，我们证实了50%的wnt3a条件培养基可以促进ES的自我更新并维持其多能性状态。其它浓度的wnt3a培养液只能维持3-5天，相反，wnt11都不能维持ES的自我更新。因此，wnt3a条件培养基培养的可能与LIF一样，可以支持ES的自我更新【4】【11】【16】.纯wnt3a对于ES的自我更新最多只能维持3天，表明wnt3a条件培养基需要其它的必须因子才能长久的维持ES的自我更新。在含有不同因子的多种培养液中，例如LIF、BMP4、MEF以及wnt3a条件培养液，添加不同的因子对于ES自我更新的调控会有不同的作用。在本研究中，在wnt3a条件培养基中添加MEK抑制剂PD098059可以抑制ES的分化，并且促进细胞的自我更新。然而，SB却不能促进ES的自我更新。在依赖于LIF的ES细胞上我们观察到了同样的结果，这与其他人们的研究结果一致。通过添加GSK3β的抑制剂，激活wnt信号通路可以维持ES细胞的多能性状态【17】。在目前的研究中，wnt3a条件下培养的ES细胞能够自我更新并维持其多能性，但wnt11无此作用。我们将ES培养了40天，传了6-8代，并对这些细胞进行冻存，然后解冻，在wnt3a条件培养基中成功的维持自我更新的状态。碱性磷酸酶染色进一步证实了wnt3a条件培养下的ES的自我更新，结果与依赖于LIF的ES的染色结果一致。类胚体证实了ES的多能性，并对其进行染色，证实分化形成中胚层。总之，我们的数据显示wnt3a条件培养基可以维持ES的自我更新以及多能性状态，而WNT11无此作用。因此，wnt3a培养体系在提高细胞移植上可能会支持ES的生长，有利于细胞移植。[4]D.Kumar,B.Sun,Transforminggrowthfactor-beta2enhancesdifferentiationofcardiacmyocytesfromembryonicstemcells,Biochem.Biophys.Res.Commun.332(2005)135–141.[11]P.Murray,D.Edgar,Theregulationofembryonicstemcelldifferentiationbyleukaemiainhibitoryfactor(LIF),Differentiation68(2001)227–234.[13]R.Nusse,WntsandHedgehogs:lipid-modifiedproteinsandsimilaritiesinsignalingmechanismsatthecellsurface,Development130(2003)5297–5305.[14]Y.Yang,Wntsandwing:Wntsignalinginvertebratelimbdevelopmentandmusculoskeletalmorphogenesis,BirthDefectsRes.C.Embryo.Today69(2003)305-317.[15]T.Reya,A.W.Duncan,L.Ailles,J.Domen,D.C.Scherer,K.Willert,L.Hintz,R.Nusse,I.L.Weissman,AroleforWntsignallinginself-renewalofhaematopoieticstemcells,Nature423(2003)409–414.[16]S.Faherty,M.T.Kane,L.R.Quinlan,Self-renewalanddifferentiationofmouseembryonicstemcellsasmeasuredbyOct4geneexpression:effectsoflif,serum-freemedium,retinoicacid,anddbcAMP,InVitroCellDev.Biol.Anim.41(2005)356–363.[17]N.Sato,L.Meijer,L.Skaltsounis,P.Greengard,A.H.Brivanlou,MaintenanceofpluripotencyinhumanandmouseembryonicstemcellsthroughactivationofWntsignalingbyapharmacologicalGSK-3-specificinhibitor,Nat.Med.10(2004)55–63.