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LeWRKY1的克隆1LeWRKY1的克隆学生姓名：陈思佳导师姓名：孙清鹏张卿摘要WRKY基因的命名是根据其所编码的转录调控因子WRKY蛋白至少还有60个氨基酸的高度保守结构域，几乎所有成员在此结构的N-端都有WRKYGQK这样的7肽，因此简称为WRKY。本实验是从保存的含有WRKY基因的大肠杆菌中提取含有WRKY基因的质粒，通过质粒重组构建以Pri101-AN为载体的重组质粒，转入大肠杆菌中，然后转入农杆菌中。关键词WRKY基因；转录因子；基因克隆WRKYtheclonesNameofstudent:ChenSijiaNameoftutor:SunQingpengAbstractOfWRKYgenesnamedaccordingtotheirencodedtranscriptionfactorsWRKYproteins,thereareatleast60aminoacidshighlyconserveddomain,almostallmembersoftheN-terminusinthisstructurehasWRKYGQK7peptide,andthereforereferredtoasofWRKY.ThisexperimentissavedwithWRKYgenesinE.coliextractcontainingWRKYgenes,plasmids,andrecombinantplasmidconstructrecombinantplasmidwastransformedintoE.coliintoPri101-AN-carrier,andthentransformedintoAgrobacterium.KeywordsWRKYgenes;transcriptionfactor;genecloningLeWRKY1的克隆1目录1WRKY的概况.....................................................11.1WRKY基因的命名、结构、分类..................................11.2W盒.........................................................21.3WRKY的发现及其演化..........................................21.4WRKY转录因子功能的多样性....................................31.4.1在生物胁迫中的作用.........................................31.4.2在非生物胁迫中的作用.......................................41.4.3WRKY转录因子在植物生长发育中的调节作用....................42pRI-101-DNA载体.................................................43材料、试剂及仪器................................................53.1材料.........................................................53.2培养基......................................................53.2.1YEB培养基.................................................53.2.2LB培养基..................................................53.2.310×TBEBuffer............................................53.3主要仪器和设备...............................................64实验方法及结果...................................................64.1大肠杆菌感受态细胞的制备.....................................64.2农杆菌感受态细胞的制备......................................64.3重组质粒的建立...............................................64.3.1提取含LeWRKY1质粒........................................74.3.2提取载体pRI101-AN质粒.....................................74.3.3目的片段的回收............................................74.3.4建立重组质粒...............................................84.3.4.1建立连接体系.............................................84.4将重组质粒转入大肠杆菌DH5α感受态中.........................84.5转基因大肠杆菌的扩大培养.....................................94.6重组质粒的鉴定...............................................94.7重组质粒转化.................................................94.8扩大培养.....................................................94.9质粒鉴定.....................................................95结果与讨论......................................................9LeWRKY1的克隆26参考文献:.......................................................27致谢............................................................1LeWRKY1的克隆11WRKY的概况植物在其长期一系列的生长发育过程中，经常会遇到生物或非生物的胁迫，而逐渐形成对恶劣环境（如病原菌、干旱、寒冷等）这些生物或非生物的胁迫作出一种积极主动反应。这种胁迫可以从调节基因表达和细胞代谢到生长速率和产量变化等引发植物产生一些列应对反应。在抵御外界生物和非生物胁迫的逆境条件下，植物基因组中有部分参与对环境变化的信号参与对环境变化的信号转导或转录调控的基因。近年来被发现植物中特有的一类转录因子家族——WRKY家族，WRKY转录因子参与了植物免疫反应在对逆境的防卫反应中起到了重要的调节作用。转录因子在基因表达的调控过程中发挥着重要作用，转录因子有称作反式作用因子，它具有特意为点的识别与结合活性，能与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用激活或抑制基因转录效应的一类DNA结合蛋白。其与靶基因上游的各种特定DNA元件结合，激活或抑制靶基因相对应的转录活性，以调控其特异性表达[1]，最终使得植物能够对外界逆境信号迅速做出正确的抵御反应。1.1WRKY基因的命名、结构、分类WRKY转录因子是一个超家族蛋白，因其各个成员的DNA结合区域都至少含有1个大约由60个氨基酸组成的高度保守WRKY结构域这个最显著的结构特点而被命名。WRKY结构域的核心序列是位于N端β折叠片包含7个绝对保守的氨基酸残基WRKYGQK，该结构域的C端是一个分典型的锌指结构：C2-H2或C2-HC[2]。WRKY蛋白根据WRKY结构域的数量及锌指结构的类型分为3类：第Ⅰ类WRKY蛋白含有2个WRKY结构域，C端的WRKY域具有结合DNA的能力其锌指结构类型是C2H2(CX4-5CX22-23HX1H)型，而N端的WRKY域功能不明。第Ⅱ类和第Ⅲ类蛋白都只有1个WRKY结构域，但其锌指结构不同。第Ⅱ类的锌指结构与第Ⅰ类相同，也是C2H2型。大多数WRKY转录因子都属于第Ⅱ类，如AtWRKY1、ABF2等。该类WRKY结构域与第Ⅰ类C-末端WRKY结构域序列的相似性比N-端WRKY结构域的序列相似性更高。第Ⅲ类锌指结构与第Ⅰ类、第Ⅱ类都不相同，为C2HC(CX7CX23HX1C)型。第Ⅲ类WRKY转录因子形成在单子叶植物与双子叶植物分化之后，只存在与高等LeWRKY1的克隆2植物中[3]。WRKY转录因子另一个主要特点是与WRKY结构域所应对的编码序列中都含高度保守的一个位置的内含子，其存在的意义还不清楚。WRKY结构域除了以上结构外，还含有核定位序列NLS，亮氨酸拉链LZS结构以及富含丝氨酸-苏氨酸域，富含谷氨酰胺域和富含脯氨酸域等结构域与转录激活功能相关[4]。WRKY转录因子一般是在细胞质中合成而后通过跨膜运输转运到细胞核，在转录水平上对基因进行调控，因此在WRKY转录因子的WRKY结构域外都存在核定位信号[5]。1.2W盒WRKY转录因子的结构域能特异性地与靶基因启动子区域的W盒，即特定的核苷酸序列(T)(T)TGAC(C/T)结合，而实现其分子生物学功能。TGAC是W盒序列的核心保守序列，此核心对于WRKY的结合必不可少。当W盒的核心序列TGAC中的任一氨基酸发生改变，WRKY蛋白与之结合的能力会减弱甚至完全消失。而且，WRKY转录因子与W盒的这种结合还需要2价阳离子，如Zn2+等金属离子的参与和磷酸化的过程等[6]。这与WRKY中的锌指结构相一致。而EDTA、蛋白激酶抑制剂酶等能抑制这样的结合。W盒主要位于许多与植物防卫如抗病、抗旱等WRKY转录因子的目标基因的目标基因的启动子区域中，含有数量不定，且它们之间的位置相近，或同向排列或形成回文结构排列，这种排列方式具有协同效应，并不是简单的相叠加，这些都有益于与WRKY的结合。W盒在排列方式、数量上的不同，因而可以与不同的WRKY转录因子结合，调控不同的目标基因[7]。即WRKY转录因子与要是通过识别特异性的W盒而启动调节下游不同功能基因的表达或调控因子的表达来应对各种诱导刺激，从而对植物的抗逆及生长发育等各种生理生化反应起到调节作用。1.3WRKY的发现及其演化Paz-Ares在1987年首次克隆出玉米转录因子，之后，研究学者们陆续在高等植物中发现数百种与干旱、低温、病原菌应答和生长发育等调控表达相关的编码转录因子的基因。LeWRKY1的克隆31994年，Ishiguro和Nakamura从甘薯中克隆岛第一个能与W盒结合的WRKY转录因子编码基因cDNA（SPF1）[8]。随后又相继在野燕麦（ABF1,2）[9]、皱叶欧芹（PcWRKY1,2,3）[10]、拟南芥（AtWRKY1）[11]、烟草、水稻（OsWRKY3,8）[12]等植物中克隆得到WRKY转录因子。截至2012年4月，NCBI中登记的WRKY基因已达4358条。第Ⅰ类WRKY转录因子不仅存在于高等植物中，还存在于蕨类植物中，甚至在例如粘液菌这种不能进行光合作用的真核细胞和单细胞原生生物贾第虫中也被检测到，因而WRKY转录因子很可能在15亿-20亿年前起源于未分化出植物界之前的真核细胞。这说明最初的WRKY转录因子的表现形式为第Ⅰ类WRKY转录因子。而第Ⅲ类WRKY转录因子都与一些苔藓类的低等植物中根本不存在，只存在于高等植物中。几乎所有的第Ⅲ类WRKY转录因子都与植物的生物胁迫应答反应有关，很有可能是由于环境压力使植物为适应而进化所产生了第Ⅲ类WR