ES细胞培养

ES细胞培养A.FBS的灭活与分装1.化冻将血清（FetalBovineSerum，Hyclone）从－20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻过夜；也可室温（或浸于自来水中）化冻，化冻后若不马上灭活，可以放入4℃冰箱暂时保存；2.灭活（1）放入室温的水浴锅内开始加热（同时放入一个内装200ml自来水的血清瓶，插入一根温度计，温度监控以此为准）；（2）当温度计显示56℃时，控制在此温度30分钟±3分钟；若不小心使温度上升超过56℃，则：若仍未超过60℃，且时间很短（比如：不超过5分钟），则仍可使用；若超过60℃，或者时间较长，则弃去不用，或者尝试用于ME细胞的培养；（2）取出，自然冷却至室温（约需1－3小时），可分装或－20℃继续冻存；3.分装（1）转入细胞间，用移液器将血清分装，注意预先要将血清轻轻摇动数周、混匀；吹出血清时要注意：不要吹出气泡（血清很粘稠，很容易产生气泡；如果已产生气泡，则在酒精灯火焰上过一下）；标好批号和日期；（2）放入－20℃冰箱冻存(分装一次大约可以使用1—2个月)。B.配制DMEM血清培养基1.提前一天将分装好的FBS从—20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻；2.在细胞间中将FBS以及其它需要添加的成分（如，丙酮酸钠、抗生素等），按照比例加入DMEM培养基中，作好标签；放入4℃冰箱保存。配制比例如下：50ml体积的干细胞培养液配制DMEM（Highglucose）/DMEM培养基（高糖谷氨酰胺（）50ul非必需氨基酸500ul丙酮酸钠500ulB-巯基乙醇？？双抗50ul血清7.5mlLIF5ulC.原代胚胎成纤维细胞（ME）的制备1.取12.5-13.5dpc孕鼠，断颈处死；2.将鼠腹面向上放置，70%酒精润湿、消毒腹部（防止腹毛飞扬，污染内脏及子宫），剪开皮肤层、肌肉层，打开腹腔，将连接在子宫上的结缔组织及脂肪剪去，将子宫取出，转入无菌10cm平皿中；3.把平皿转入超净台；4.用镊子打开子宫壁，挤出鼠胚，并与胚外组织、胎盘等分离，除去鼠胚的头、四肢及各种内脏（主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等）；5.将鼠胚移入另一新的无菌皿，用PBS洗三次；6.弃去PBS，用弯头剪将鼠胚剪碎，加入PBS洗至溶液基本无色（1－4次）；7.加入适量Trypsin-EDTA（0.25%Gibco25520，下同），体积约等于组织块体积；8.用滴管轻轻吹匀，室温下消化1－10分钟（或消化至溶液浑浊变粘），加入与消化液等体积培养基，轻轻吹打混匀（5－10次），静置；9.沉降后将上部溶液轻轻吸出，转入离心管中。10.将细胞悬液管离心（1000转5分钟）；11.弃去上清，向沉淀中加入适量培养基，轻轻吹打重悬，将其分种至10cm细胞培养皿，补加适量培养基，作标签（ME－0；注意：若冻存，则可以使用复苏后的0代ME制作Feeder；若直接使用则最好不用0代ME细胞做Feeder，要传到一代以后再用来制作Feeder比较好），转入培养箱培养；12.视细胞生长情况换液（一般3天换液一次），若细胞已长满，则冻存，或者1：3-5传代（视细胞疏密而定），放入培养箱继续培养（此后不用再换液）；1－5代的ME细胞均可用来制作Feeder。饲养层细胞（Feeder）的制备注：含10ug/ml丝裂霉素C的DMEM血清培养基（FBS占10%）（实验室所用MMC为10mg/mL，Calbiochem）1.弃去细胞培养皿中的培养液，加入适量含10ug/ml丝裂霉素C的培养基（DMEM+10%FBS）；2.放入培养箱培养3小时（2－4小时）；3.用0.1%明胶处理培养皿（将明胶加入，摇动使明胶覆盖全部皿底，然后吸出明胶弃去即可），室温放置2小时以上，至皿底明胶干燥为止；4.弃去含有丝裂霉素C的培养基，加入2－3mLPBS，轻轻摇动，弃去PBS，如此洗3-5次（必须洗3次以上，以便彻底洗去残存的丝裂霉素，丝裂霉素是有丝分裂抑制剂，因而对ES细胞有毒性）；24.加入适量胰酶消化30秒，吸去消化液，静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁为止，加入培养基，吹打，种至明胶处理过的培养皿中即可（如细胞过稀，可再补加丝裂霉素处理过的细胞），半小时后即可使用（如果急用，则可以用ES细胞培养基终止消化，然后与ES细胞一起转入明胶处理过的新板上），可使用6－10天，用前更换培养液（如未用明胶处理培养皿，则需在培养箱中放置2小时以上方可使用；最好是前一天下午制作Feeder，第二天上午使用，这时的Feeder状态最好，最适于ES细胞贴壁生长，而且万一制作的Feeder在第二天早上发现出了问题，还可以赶紧补做）。ES细胞培养基DMEM+15�S2-巯基乙醇：5.5uM1000XGibco21985-023L-谷氨酰胺：2mM100XSigmaG8540LIF：1000U/mL10000XChemiconESGRO®(LIF);10E7units，货号:ESG1107非必需氨基酸：100uM100XGibco11140-050双抗：100XGibco15070-063ES细胞的复苏1.提前制备好相应数量的Feeder；2.准备37－39℃的热水，从液氮罐中取出所需冻存管（冻存细胞），迅速投入热水中，迅速剧烈摇动直至冻存液全部融化；3.转入无菌间，1000转/分钟离心5-10分钟；4.弃上清，加入1mlES培养液轻轻吹打重悬，转入铺有饲养层细胞的培养皿中（冻存前细胞来自多大的培养皿，复苏时就用相应大小的培养皿），补加适量培养液；5.转入培养箱培养，次日换液；此后每24小时换一次液，每48小时传一次代（视生长情况）。ES细胞的换液1.提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温（或者放于37℃温箱内）；2.细胞培养皿从培养箱内取出，相差显微镜下作常规观察（判断生长情况，并确证未发生污染）后转入无菌操作台内；3.将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，换新鲜培养基（6cm培养皿约5mL，3.5cm培养皿约3mL培养基；若死细胞较多则可以先用PBS洗一次，再加培养基）；4.放回培养箱继续培养。ES细胞的传代1.前一天下午做好所需数量的Feeder细胞板；2.提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温（或者放于37℃温箱内）；3.将ES细胞培养皿、Feeder细胞培养皿从培养箱内取出（相差显微镜下作常规观察，Feeder细胞应生长良好，细胞覆盖95%左右，至少90%以上的培养皿面积）；ES细胞应生长良好，接近长满培养皿，细胞集落大小一致、疏密均匀，集落形状规则、呈椭圆形、边缘光滑、表面光滑，细胞生长致密、核大、胞质少；4.将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，用PBS1mL左右洗一遍，加入胰蛋白酶溶液，作用约30秒，小心吸出胰蛋白酶溶液，弃去；再作用1—5分钟，不时观察，待细胞层（皿底一层白色脏东西样膜）出现裂缝并明显开始下滑时，补加培养基，适度吹打（视消化程度及管口粗细而定，至看不到明显的大的细胞团块为止）；平均分到Feeder培养皿中（滴加，以免将Feeder细胞吹脱落下来），滴加补加培养基至5ml左右（滴加，以免将Feeder细胞吹脱落下来；若为3.5cm培养皿，则补加至3ml左右），作好标签；5.前后左右水平晃动培养皿，使ES细胞均匀分布于培养皿中，放入培养箱继续培养。ES细胞的冻存1.常规方法将细胞消化成单细胞悬液；2.转入试管，1000转/分钟离心5分钟；3.配适量冻存液（为含10%二甲亚砜（DMSO），10%FBS的DMEM培养液）；4.弃上清，每管加入1ml冻存液，吹打成细胞悬液（只要使ES细胞分散成3—5个细胞的小团块即可），转入冻存管，作好标签；5.放入程序冻存盒内24小时后转入液氮罐中冻存。