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Chelex法提取血液（斑）DNA原理:Chelex是由苯乙烯与二乙烯苯的共聚体组成的螯合树脂，其亚氨基二乙酸侧链起着螯合金属离子的作用，防止在其煮沸过程中DNA的降解，在高温低离子强度下也起着催化DNA释放的作用。对检材的条件要求液体血用EDTA溶液（0.5MEDTA：血=50μl：3ml）或枸橼酸钠溶液（2.5%枸橼酸钠：血=1：4）抗凝，勿用肝素抗凝，须冷藏保存送检。操作步骤:1、取4μl血液（或3×3mm2血斑样品）放入0.5ml的离心管中，加入0.5ml纯水，振荡混匀，室温浸泡15-30分钟。2、13,000rpm离心3分钟，去除上清液〔上清液可用于做抗人血红蛋白（FOB）金标试剂条检验〕，若是血斑则保留载体。3、加入200μl5%Chelex-100溶液，56oC保温15-30分钟，振荡5-10秒。4、沸水中煮8分钟（或在热循环仪上100oC保温8分钟），振荡5-10秒。5、13,000rpm离心3分钟，4oC保存备用。注意事项：1、5%Chelex-100溶液使用前摇匀，用量视检材的量而定。2、液体血用EDTA溶液（0.5MEDTA：血=50μl：3ml）或枸橼酸钠溶液（2.5%枸橼酸钠：血=1：4）抗凝，冷藏送检。3、液体血涂在滤纸或脱脂纱布上制成血斑时，应在室温下自然晾干，放入纸袋内送检。4、血斑应保留载体，皮革上的血迹最好用纱线转移提取。5、纯水洗一次后，若颜色还很红，可用水再洗一遍。6、微量血斑可不经水洗，直接加入适量5%Chelex-100溶液保温。7、陈旧血斑可加入蛋白酶K，并适当延长保温时间。Chelex法提取唾液（斑）DNA适用范围：该方法适用于各种载体上的唾液斑，常见的有口腔拭子、烟蒂、邮票、信封折口、牙刷、果核、饮料罐、水杯、面罩及咬痕等。原理：Chelex是由苯乙烯与二乙烯苯的共聚体组成的螯合树脂，其亚氨基二乙酸侧链起着螯合金属离子的作用，防止在其煮沸过程中DNA的降解，在高温低离子强度下也起着催化DNA释放的作用。在Chelex中加入蛋白酶K，有助于口腔上皮细胞的消化。操作步骤1、取3×3mm2唾液斑样品（过滤嘴纸质外层、唾液斑转移纱线）或剪取牙刷刷毛1束，放入0.5ml的离心管中，加入0.5ml纯水，振荡混匀，室温浸泡15-30分钟。2、13,000rpm离心3分钟，去除上清液，保留载体。3、加入100μl5%Chelex-100溶液和5μl2mg/ml蛋白酶K，56°C保温2小时以上，振荡5-10秒。4、沸水中煮8分钟（或在热循环仪上100°C保温8分钟），振荡5-10秒。5、13,000rpm离心3分钟，4°C保存备用。注意事项：1、多枚烟蒂应分别放入不同纸袋内送检，标明商标和提取地点。2、口腔拭子应在室温下自然晾干，放纸袋内送检。3、饮料罐、水杯口上的唾液斑可分两步提取转移，先用湿棉签或纱布擦拭，再用干棉签或纱布擦拭，一并放入离心管中提取DNA。擦拭时尽量少用载体。4、对于量少的检材可不经水洗，直接加入5%Chelex-100溶液和蛋白酶K保温。Chelex法提取组织DNA适用范围：人体的各种器官组织如心脏、脑、肌肉、软骨及毛根等。原理：Chelex是由苯乙烯与二乙烯苯的共聚体组成的螯合树脂，其亚氨基二乙酸侧链起着螯合金属离子的作用，防止在其煮沸过程中DNA的降解，在高温低离子强度下也起着催化DNA释放的作用。在5%的Chelex-100中加入蛋白酶K溶液，有助于组织细胞的消化和DNA释放。操作步骤1、剪取组织约1mg，放入0.5ml的离心管中，加入200μl5%Chelex-100溶液和10μl的2mg/ml蛋白酶K；剪单根毛发的毛根，加入50μl5%Chelex-100溶液和5μl2mg/ml的蛋白酶K，56ºC保温2小时以上，振荡5-10秒。2、沸水中煮8分钟（或在热循环仪上100ºC保温8分钟），振荡5-10秒。3、13,000rpm离心3分钟，4ºC保存备用。注意事项1、焚烧的尸体应取深层肌肉，严重腐烂尸体应提取软骨。2、多根毛发的毛根应分别提取DNA。3、带毛根的毛发干燥状态下保存送检，组织应冷冻保存送检。4、组织DNA含量较大，取材时不要过量。5、若组织表面较脏，应先用纯水冲洗，去除烟尘、泥土等杂质。6、毛根表面若粘有血迹或其他斑迹，应先用脱脂棉蘸纯水擦拭干净。Chelex法提取指（趾）甲DNA适用范围该方法适用于人类指（趾）甲。原理指（趾）甲的主要成份为α-角蛋白，也含有人体细胞。在二硫代苏糖醇（DTT）存在的条件下，蛋白酶K可将α-角蛋白水解，在高温下破坏细胞内的膜结构，释放出细胞内的线粒体DNA、核DNA。对检材的条件要求样品表面清洁，面积在5mm2以上。操作步骤1、清洁指（趾）甲的表面：先用洗涤剂或去污剂的稀释溶液擦洗指（趾）甲的表面，然后用手术刀片再刮去一层表面，最后用纯水清洗，取出后用滤纸压干。2、将适量指（趾）甲样品剪为碎片，转移至0.5ml的离心管中，加入100µl5%Chelex-100溶液，10µl4MDTT溶液，10µl5mg/ml蛋白酶K溶液，混匀，56°C保温4小时以上。3、沸水中煮8分钟（或在热循环仪上100ºC保温8分钟），振荡5-10秒。4、13,000rpm离心5分钟，4°C保存备用。注意事项1、对于一些难于酶解的检材可以适时、适量补加蛋白酶K。2、Chelex法提取后的检材，可使用Promega公司的DNAIQ系统进行纯化，浓缩。Chelex-100法提取混合斑中女性DNA适用范围该方法适用于混合斑中女性DNA的提取。原理在没有DTT存在的情况下，混合斑中的精子不会裂解释放出DNA，用Chelex-100法提取到的混合斑中DNA主要为女性DNA。操作步骤1、取3×3mm2混合斑检材放入0.5ml的离心管中，加入200μl5%Chelex-100溶液和10μl2mg/ml蛋白酶K，56ºC保温1小时以上，振荡5-10秒。2、13,000rpm离心3分钟，吸取上清液至0.5ml的离心管中，沸水中煮8分钟（或在热循环仪上100ºC保温8分钟），振荡5-10秒。3、13,000rpm离心3分钟，4ºC保存备用。注意事项1、通常STR检验分型结果为单一的女性基因型，男性谱带的峰值很低，与背景噪音相当。2、特殊情形下，如混合斑中若混有男性血或含有大量男性上皮细胞等，则STR分型为混合谱带。Chelex法提取混合斑中精子DNA适用范围该方法适用于阴道拭子和各种载体上含有精子的混合斑。原理利用女性上皮细胞与精子结构上的差异，首先在蛋白酶K和SDS作用下裂解上皮细胞，分离去除上清(女性DNA)、保留沉淀(精子的头部)，漂洗去除残留的女性DNA；在DTT、蛋白酶K、Chelex(螯合树脂，防止煮沸过程中DNA的降解)存在的情况下，进行二次消化，释放出精子DNA。操作步骤1、将带有精子的检材约2cm2剪碎，装入1.5ml离心管A中，加lmlTNE溶液或去离子水，37℃浸泡30分钟。〔可13000rpm离心3分钟，后取100ul上清溶液做抗人前列腺特异抗原（PSA）金标试剂条检验，再在A管中补加100ul的TNE，振荡〕然后加入10%SDS（约100ul）至终浓度1%，加蛋白酶K（约10ul）至终浓度100ug/ml，37℃保温2小时以上（时间长些效果会更好，因而可过夜）。2、套管离心（将A管底部用针穿一个洞，套在另一个管B中），13000rpm离心5分钟（或可用5000rpm离心10分钟、或可用10000rpm离心8分钟），弃A管。3、弃B管中上清液，沉淀物加入1mlTNE溶液或去离子水振荡重悬，13000rpm离心5分钟离心，弃上清液；如此反复漂洗一至五次，后B管中保留20-30ul的液量做精子DNA提取。（沉淀物可保留一半以备女性物质去除不净时再次进行消化。）4、沉淀物中加入200ul5%Chelex-l00溶液、20ul10mg/ml蛋白酶K和10ul1MDTT，56℃30分钟至4小时（或过夜）。5、振荡5-10秒，98℃8-10分钟，振荡5-10秒。6、13000rpm离心3分钟，4℃或-20℃保存备用。注意事项1、检材用量不要过大，以利于充分浸泡、消化，并避免DNA模板浓度过高，导致小片段优势扩增。2、女性物质过多时，可延长第一步消化时间，增加漂洗次数;或将保留的一半沉淀物再次进行消化。3、遇有抑制物干扰时，可通过稀释或用DNAIQ系统纯化模板DNA来解决。DNAIQ系统纯化DNA适用范围该方法适用于DNA的纯化。原理本方法运用DNAIQ系统，对有机法和Chelex-100法提取的DNA进行纯化。在高浓度chaotropicsalt（NaI、硫氰酸胍和盐酸胍等）存在的条件下，核酸吸附到二氧化硅上，而在低盐条件下被洗脱下来。操作步骤1、剪取适量检材于1.5ml离心管中，加200ul配制好的裂解液（100ul裂解液+1ul1MDTT），95℃保温30分钟；2、套管离心，去掉载体，将上清液转移至另一个1.5ml的离心管；3、离心管中加入2倍体积配制好的裂解液和7ul树脂，漩涡振荡使树脂悬浮，室温放置5分钟，期间震荡3-5次，以使树脂保持悬浮；4、旋涡振荡后将离心管置于磁架上，小心弃去液体；5、加100ul配制好的裂解液，旋涡振荡使树脂悬浮，将离心管放在磁力架上，小心弃去液体；6、加100ul配制好的1х洗液（2х洗液：无水乙醇：异丙醇=2：1：1），旋涡振荡使树脂充分悬浮，将离心管放在磁力架上，小心弃去液体；7、重复三次步骤7，最后一次尽量将上清液吸干净；8、打开离心管盖子，室温下空气干燥5分钟；9、加入50ul纯水，旋涡振荡使树脂悬浮，离心管放在加热块上，65℃保温5分钟，期间振荡3-5次;10、取出离心管，旋涡振荡使树脂悬浮后，立即将离心管置于磁力架上，小心将DNA溶液吸出至干净管中备用；注意事项1、待纯化的样品在加入裂解液后仍呈粘稠状，会影响磁铁架吸附树脂，导致离心管放入磁架后树脂不贴壁，仍呈悬浮状，此时应用裂解液进一步稀释，或步可将样品在56℃加热1分钟，溶液即可澄清；。2、每步应尽量吸净液体。3、旋涡振荡充分，使树脂在每次洗涤中不发生凝结。4、干燥时间不要超过20分钟。5、低温洗脱导致回收率低，洗脱时应置65o保温5分钟。6、7μl树脂只能吸附约100ngDNA，因此无需加入过多的DNA。Micoron100柱纯化方法1、分别标记两个编号一样的1.5ml管×（A管、B管）；2、将已用CHELEX100法或有机法等已制备好的DNA，13000rpm离心3分钟；3、将micoron100柱放在离心管A上，往柱子里加适量已制备的DNA（约30-50ul即可），再往柱子里加100ul去离子水，盖上盖子；4、将离心管A（套有柱子）1000rpm离心5-10分钟（柱子内约保留20-30ul的溶液）；5、从离心管A上拆下micoron-100柱（弃A管），将micoron-100柱翻转后放在离心管B上，盖上盖子；6、将离心管B（套有柱子）13000rpm离心5分钟；7、弃柱子，收集的DNA溶液保留在离心管B中备用。抗人血红蛋白（anti-Hb）金标试剂条检验人血液（斑）适用范围该方法适用于疑含有人血的所有检材。原理抗人血红蛋白金标试剂条检验人血的基本原理是双抗体夹心法。吸附于试剂条加样区的金标记单克隆抗人Hb抗体与含有人血的检材（样本）浸泡液反应后，形成金标记抗体抗原复合物，并向试剂条吸附区扩散，当扩散至试剂条预粘附有线性未标记的单克隆抗人Hb处时，与未标记的单克隆抗人Hb反应，并沉淀于该处，形成紫红色沉淀带（检测线）。如果检材（样本）浸泡液中无Hb则不能形成紫红色沉淀带。吸附于试剂条加样区的多余金标记单克隆抗人Hb抗体越过检测线，继续向试剂条吸附区扩散，当扩散至试剂条预粘附有线性标记的羊抗鼠IgG处时，形成紫红色沉淀带（质控线）。对检材的条件要求人血稀释8万倍以下或人Hb含量1000ng/ml以上。操作步骤剪取适量大小疑含有人血斑检材或吸取适量疑含有人血液检材，于0.5ml离心管内，加入450μl纯水，室温放置30分钟，不时振荡，13