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浙江万里学院生物与环境实验中心1《生化实验技术》实验设计方案实验项目：玉米基因组DNA的提取与转基因成分分析专业：生物工程班级：101日期：11月5日一、实验目的：1、掌握提取植物组织基因组DNA的基本方法。2、掌握二苯胺法和紫外分光光度法测定DNA含量的原理和方法。3、学会转基因植物转基因成分的分析4、学习DNA的水平式琼脂糖凝胶电泳并学会操作。5、掌握高速冷冻离心机、微量移液枪、水平电泳仪等仪器设备的使用。二、实验原理：核酸是生物有机物体重的重要组成成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起。核酸分为DNA和RNA两大类，前者主要存在于细胞核内，后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。苯酚可使蛋白质变性，蛋白质溶于酚相，DNA则溶于上层水相。将氯仿与苯酚混合使用，可减少酚相中因水的存在而造成DNA的少量溶解。95%乙醇可使核酸从水相中沉淀出来，用70%的乙醇洗涤可以除一些盐分，经Rnase降解RNA，可得较纯的DNA。DNA含量与纯度测定，目前常用紫外吸收法，利用核酸在260nm有吸收峰，根据公式[DNA(μg/mL)=A260*50*稀释倍数]可计算出核酸DNA的浓度。由于蛋白质在280nm有吸收峰，可根据比值判断DNA纯度：A260／A280＜1.8时，表明蛋白质含量偏高；1.8＜A260／A280＜1.9时，表明样品较纯；A260／A280＞2.0时，表明RNA或DNA碎片较多。二苯胺法定量测定DNA的原理为：在强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，产生嘌呤碱基、脱氧核糖与嘧啶核苷酸。其中，2’-脱氧核糖在酸性环境中成为w-羟基-r-酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。DNA在40-400ug范围内光吸收值与DNA含量成正比。在转基因技术中，外源基因导入到植物体中时，通常使用花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子启动下游编码基因的转录。在染色体中，一个转录单位由启动子序列，编码序列和终止序列组成，常用终止序列是胭脂碱合酶（NOS）的编码序列的终止序列。这部分序列相对于被浙江万里学院生物与环境实验中心2导入植物而言，属于外来基因序列，所以非转基因植株不含该段核苷酸序列。针对CaMV35S启动子或NOS终止子序列进行分析，即可定性分析植株体是否为转基因品种。电泳（electrophoresis）是荷电溶质或粒子在电场作用下发生定向泳动的现象。核酸的分离和鉴定通常采用琼脂糖凝胶电泳。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用溴化乙啶（EB）染色，在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。三、实验仪器：离心机、冰箱、恒温水浴箱、紫外分光光度计、水平电泳槽、电泳仪电源、凝胶成像系统、量筒、移液管、烧杯、玻璃棒、试管、离心管、容量瓶等四、材料与试剂（请写明具体配制方法及使用的量）：1、材料：玉米片2、试剂：（一）基因组DNA的提取和纯化1.淀粉酶（可选），1500单位/mg-3000单位/mg蛋白质2.三氯甲烷（CHCl3）3.98%乙醇（C2H5OH）4.乙二胺四乙酸二钠盐Na2EDTA（C10H14N2O8Na2）5.CTAB（C19H42BrN）6.37%盐酸（HCl）7.异丙醇（CH3CHOHCH3）8.蛋白酶K（可选），冷冻状态下约50单位/mg9.RNA酶（可选），不含DNA酶，冷冻状态下约50单位/mg10.氯化钠（NaCl）11.氢氧化钠（NaOH）12.TRIS（C4H11NO3）13.淀粉酶溶液（可选）淀粉酶10mg/ML，不要灭菌。-20摄氏度保存，避免反复冻融14.CTAB-1提取缓冲液（PH8.0）称取4.00gCTAB，16.38g氯化钠，2.42gTRIS，1.50gNa2EDTA，4.00gPVP-40，用适量水溶解后，调节PH，定容至200ml，高压灭菌。临用前按使用量加入巯基乙醇，使其浙江万里学院生物与环境实验中心3终浓度为2%。15.CTAB-2提取缓冲液（PH8.0）称取4.00gCTAB，16.38g氯化钠，2.42gTRIS，1.50gNa2EDTA，用适量水溶解后，调节PH，定容至200ml，高压灭菌。16.CTAB沉淀液（PH8.0）称取1.00gCTAB，0.50g氯化钠，用适量水溶解后，调节PH，定容至200ml，高压灭菌。17.氯化钠溶液（NaCl），1.2mol/L18.70%乙醇（C2H5OH）19.蛋白酶K溶液（可选）蛋白酶K约20mg/ml，无菌水溶解，不要灭菌，-20摄氏度保存，避免反复冻融20.RNA酶溶液（可选），RNaseA10mg/ml，分装后-20摄氏度保存。21.TE缓冲液（PH8.0），TRIS0.01mol/L，Na2EDTA0.001mol/L，用HCl或NaOH调节PH。设备和器材1．摇床2．离心机3．涡旋振荡器4．真空干燥器（二）紫外分光光度计法检测DNA纯度与含量DNA标准液：100μg/mL（三）二苯胺法测DNA含量①DNA标准溶液：取标准DNA以0.01mol/L氢氧化钠溶液配成200μg/mL。②DNA样品液：（自己提取）控制其DNA含量在50－100微克/毫升左右。③二苯胺试剂：称取0.8克二苯胺试剂，溶于180毫升分析纯的冰醋酸中，再加入8毫升过氯酸（A.R，60%以上），混匀备用。临用前加入0.8毫升1.6%乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可使用）。所配得的溶液应为无色。（四）DNA琼脂糖凝胶电泳①Tris-硼酸-EDTA缓冲液（TBE缓冲液），pH8.3：称取10.78gTris，5.50g硼酸，0.93gEDTA-Na2溶于去离子水，定容至1000mL。浙江万里学院生物与环境实验中心4②琼脂糖：1g溶于TBE缓冲液中加热配成100mL。③0.05%溴酚蓝-50%甘油溶液（5×LoadingBuffer）：取一定量的0.1%溴酚蓝水溶液，与等体积甘油混合而成。④0.5μg/mL溴化乙啶染色液：称取5mg溴化乙啶，用去离子水溶解，定容至100mL。从中取1mL，用无离子水稀释至100mL。（有毒，戴手套，通风柜内进行。）⑤DNAMarker(五)PCR扩增CaMV35S启动子，基因Lectin序列1.水2.10XPCR缓冲液（不含氯化镁）3.氯化镁溶液：25mmol/L4.dNTP溶液:2.5mmol/L5.引物6.正向引物：CaMV35S启动子（Genebank编号：V00141）5'-GCTCCTACAAATGCCATCA-3'反向引物：CaMV35S启动子（Genebank编号：V00141）5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3'7.正向引物：玉米IVR基因（Genebank编号：U16123）5'-CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACT-3'反向引物：玉米IVR基因（Genebank编号：U16123）5'-GGAGCCCGTGTAGAGCATGACGATC-3'五、实验流程（技术路线）：浙江万里学院生物与环境实验中心5六、实验步骤：（一）基因组DNA的提取和纯化CTAB-1法A）称取100mg样品至2mlEppendorf离心管中，加入700μLCTAB-1缓冲液，涡旋振荡混匀后于65℃温育30min，期间颠倒混匀离心管2次～3次。B）加入700μL的三氯甲烷-异戊醇，涡旋振荡混匀后放置10min。期间颠倒混匀离心管2次～3次；12000g离心5min。C）转移上清液至1.5mLEppendorf离心管中，加入0.6倍体积经4℃预冷的异丙醇，于-20℃下静置5min，12000g离心5min，小心弃上清液。D）加入70%乙醇1000μL，倾斜离心管，轻轻转动数圈后，4℃下8000g离心1min，小心弃去上清液；加20μLRNaseA酶（10μg/mL），37℃温育30min。E）加入600μL氯化钠溶液，65℃温浴10min。加入600μL的三氯甲烷-Tris饱和酚，颠倒混匀后，12000g离心5min，转移上层水相至1.5mLEppendorf离心管中。F）加入0.6倍体积经4℃预冷的70%异丙醇，颠倒混匀后，于4℃下静置30min；4℃下12000g离心10min，小心弃去上清液。G）加入1000μL经4℃预冷的70%乙醇，倾斜离心管，轻轻转动数圈后，4℃下12000g离心破碎细胞CTAB-2法提取DNA氯仿－异戊醇抽提去除蛋白质等杂质乙醇沉淀法收获DNARNase处理去除RNA获得纯净的DNADNA检测和鉴定紫外法检测DNA纯度二苯胺法测DNA含量PCR扩增目标序列DNA琼脂糖凝胶电泳浙江万里学院生物与环境实验中心610min，小心弃去上清液；用经4℃预冷的70%乙醇按相同方法重复洗一次。室温下或核酸真空干燥系统中挥干液体。H）加50μLTE缓冲液溶解DNA，4℃保存备用。注：转移上清液时注意不要吸到沉淀、漂浮物和液面分界层。（二）紫外分光光度计法检测DNA含量与纯度将纯化的DNA溶液用TE（pH8.0）稀释至每毫升含5-50μgDNA浓度范围，用TE（pH8.0）作空白对照，于紫外分光光度计上测定260nm、280nm吸收值，计算A260/A280的比值分析DNA的纯度，并换算出核酸的含量。（三）二苯胺法测DNA含量1、DNA标准曲线的制作取8支试管，编号，按下表加入试剂管号试剂ml01234567DNA标准液00.20.40.81.01.21.62.0蒸馏水21..81.61.21.00.80.40二苯胺试剂44444444加毕，摇匀，于60℃恒温水浴中保温1小时，（或于沸水中煮沸15分钟，冷却测0D595nm值。）以光密度为纵坐标，DNA含量（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。2、样品的测定取2支试管，各加0.2－0.5毫升的待测液（内含DNA应在标准曲线可测范围之内）加蒸馏水稀释至2毫升，再加4毫升二苯胺试剂，摇匀，其操作步骤与标准曲线的制作相同。根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度DNA的含量，按下式计算出样品中DNA的百分含量。（四）DNA琼脂糖凝胶电泳1、琼脂糖凝胶液的制备称1g琼脂糖，置于三角烧瓶中，加入100mLTBE缓冲液，瓶口扣上一小烧杯，加热至微沸，琼脂全部融化。取出摇匀，即为1%琼脂糖。2、凝胶板的制备置水平板于工作台面上，将样品槽模板（梳子）插进水平板上凹槽内，距一端约0.5cm。梳子底边与水平板表面保持0.5-1mm的间隙。待琼脂糖冷至65℃左右，小心地倒入托盘内，浙江万里学院生物与环境实验中心7使凝胶缓慢地展开在水平板表面形成一层约3mm厚均匀胶层。静置0.5小时。待凝固完全后，用滴管在梳齿附近加人少量缓冲液润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板，则在胶板上形成相互隔开的样品槽。将凝胶连同水平板放入电泳槽平台上。倒入PBS缓冲液直至浸没过凝胶面2-3mm。3、加样将待测DNA样品液与5×LoadingBuffer以4：1的体积比混合，用移液枪分别加人到凝胶板的加样槽内。每个糟加10μL左右。加样时，使样品集中沉于槽底部。DNAMarker取5μL直接进行加样。4、电泳加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极，接通电源，开始电泳。样品进胶后，应控制电压降不高于5V/cm(电压值V/电泳板两极之间距离比)。当溴酚蓝条带移动到距离凝胶前沿约lcm时，停止电泳。5、染色将电泳后的胶取出，小心推至溴乙锭染色液中，室温下浸泡染色30min。6、观察与拍照小心地取出凝胶置托盘上，并用水轻轻冲洗胶表面的溴化乙锭溶液，再将胶板推至凝胶成像系统的样品板上，在紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带，拍照记录下电泳图谱。（五）PCR扩增PCR反应的总体积为25ul，反应体系见表。可以在不改变试剂浓度的情况下，适当扩大反应体系。试剂终浓度加样体积/ul样品DNA10