影响微生物灭活的各种因素

第三节影响微生物灭活的各种因素影响微生物灭活的因素很多，除了压力外，保压时间、温度、加压方式、升压和卸压速率、食品组分、溶剂、微生物的种类、生存状态、初始菌量、介质的pH值和水分的活度等。1压力对灭菌的影响压力作为热力学参数是众所周知的，它也可以象温度一样对生物材料产生影响，但在有关研究领域没有受到足够的重视，这主要是人们对压力引起的生物材料特性的变化缺乏了解。随着物理学和生物物理学研究的不断深入，人们可以利用压力对生物分子的功能和生物过程的热力学及动力学进行细致的描述。与加热灭菌类似，随着压力的升高，灭活率提高。低于某一压力时，微生物不能失活，或者发生可逆性失活，经过一段时间，还会恢复活性。超过这一压力就会发生不可逆失活，这一压力值也称作压力阈值。每一种微生物，在不同的特定条件下，都有一定的压力阈值。随着压力的增大，微生物灭活率提高，直到全部杀灭或大部杀灭。同一个菌种在不同的条件下，对压力的耐受性也不相同。大肠杆菌在培养基（胰蛋白胨1，酵母抽提粉0.5，NaCl1，pH7.5，琼脂1.5，121℃20min灭菌）中，200MPa既可以灭活。而在pH6.4，5min条件下，需用280MPa灭活大肠杆菌。大森丘在肉与肉制品植入的大肠杆菌在200MPa时数量并未减少，300MPa以上的超高压才能将其杀灭；崛江(1991)将大肠杆菌接种在苹果酱中，实验结果表明，加压300MPa、20min后，可达到商业无菌要求。图3.2是大肠杆菌的两个不同超高压灭活实验所得到的结果。图3.2超高压灭活大肠杆菌的实验曲线1由于各种微生物、酶耐压性不同，所以杀死不同微生物、酶需不同层级的压力。一般来说，常温下200MPa一300MPa压力可杀灭细菌、霉菌、酵母菌的营养体及病毒、寄生虫；600MPa以上才能杀死耐压性高的芽抱杆菌属的芽抱。对于酶类，100MPa一200MPa可使一般性酶失活；50一60℃，700MPa以上可使耐压性高的过氧化物酶、果胶酯酶等失活。因此若在不恰当工艺条件下仍可能有微生物、酶存在，与光、氧接触后仍会使食品腐败变质。压力越高，则处理所需的时间越短。资料表明，在20-25℃下加压处理粘质沙雷氏菌、乳链球菌、荧光假单胞菌和产气气杆菌时，当压力为200—30OMPa时，需加压处理60min才能杀死；而在340—400MPa时，只需50min。酵母(低发酵度酿酒酵母和白酵母)在200～240MPa压力下必需处理60min才死灭，而370～400MPa时仅10min，570MPa时5min即可。这种现象类似于加热杀菌中出现的低温长时、高温短时和超高温瞬时杀菌，故也可将超高压杀菌分为低压长时(LPLT)、高压短时(HPST)和超高压瞬时杀菌(UHP)。林力九(1993年)提出的设想是：LPLT杀菌是指在400MPa左右加压处理10-20min；HPST指在600MPa左右加压处理1-2min；UHP指在600MPa以上加压处理几秒至1min以内。但是对一些芽孢，在某一段压力范围施压，反而促使其生长。例如常温(30℃)下，将嗜热脂肪芽孢杆菌菌数不同的试祥分别经超高压处理10min，压力值为100、200、300、400和500Mpa．在上述条件下，压力处于200－400Mpa范围内时，嗜热脂肪芽孢杆菌具有较高的死灭率。随着压力的进一步升高(400Mpg以上)．菌残存率反而升高了。这可能与芽孢菌的特性有关。由于孢子的外层结构有细致紧密而坚硬的双层膜，内含浓缩的蛋白质，营养丰富且处于休眠状态，因而对高温高压等恶劣环境具有很强的抵抗能力。适当的压力(200—400Mpa)可以促使孢子发芽，生成的营养体就很容易被压力破坏。若压力过高(400MPa以上)，则孢子的发芽又会受到抑制，从而在压力环境中保存下来。释压后，孢子经复原培养基的活化，有可能还原成活细胞，使菌残存率增加。因此，压力并非越高越好。尤其对芽孢菌而言，杀死孢子的有效途径之一是提供适当条件促使孢子发芽，然后进行高压灭菌或配合其他协同灭菌作用。2保压时间的影响压力一定的条件下，一般随着保压时间的延长，灭菌效果越好。但是存在一2个临界时间。就是说加压到了一定时间，再延长时间，灭菌效果也不会有太明显的提高。另外，保压时间的长短，还取决于施加压力的大小。压力越高，所需要的时间就越短（图3.3）。1.160Mpa2.200Mpa3.230Mpa（25℃）图3.3时间对灭菌（大肠杆菌）效果的影响图b是固定压力240MPa和pH值为6.4时，保压时间与大肠杆菌死亡率的关系。从图中可以看出，随着保压时间的增大，细菌的致死率急剧增大。我们发现瞬时压力的效果不是很好，大概只有20%的死亡率。而保压时间达到10分钟时，死亡达到90.49%，由此可见，保压时间也是影响杀菌效果的一个重要因素。压力大小与保压时间合理协调使用，可以解决超高压加工工艺中的一些问题，例如在超高压设备的工作压力受限制时，可以通过延长保压时间来弥补，达到灭菌的效果。若从提高效率的角度来看，提高压力则可以增加产量，但是这样会提高超高压设备的造价和投资，两者要综合考虑，才能得到比较经济的合理方案。另外还有一个现象，高压短时间加压与较低的压力长时间加压相比较，后者比前者的非在位效应显著，即加压后的一段时间内，菌类继续失活的速率比前者高。3温度的影响热和压力是决定物质状态代表性的两大因素，可以相互独立而互相转化。将流体强力压缩，则温度升高，在密闭的容器中将气体加热，则压力升高。另外温度和压力两个条件同时影响物质的状态，例如冰点、沸点。温度是影响微生物生长代谢的重要外部条件，环境温度超出微生物的承受能3力，就会导致微生物死亡。微生物对温度有敏感性，在低温或高温下，高压对微生物的影响加剧。虽然压力与温度对微生物的生命活动，在作用机制、作用效果及影响因素等方面存在差异，但两者对微生物的致死却存在着协同和互补作用。众多的研究结果表明，低温条件下，压力会使冰晶析出而加剧微生物组织破裂的程度；加压条件下，加热又会促进微生物中蛋白质、酶等成分的进一步变性，强化杀菌作用的效果。一般在微生物最适合繁殖的温度灭菌最困难。降低和提高温度都有助于杀灭微生物（参见图3.4）。这一点类似于蛋白质变性的椭圆曲线。当温度超过６０℃后，温度就会变成为灭菌的主要条件之一。压力和温度协同影响微生物失活的主次关系还很难断定。如果食品的温度高于室温或低于室温，在UHP加工处理中，都会提高微生物的失活率。45℃-50℃的温度更容易使食品病原体和腐败微生物失活，因此这就要求优化生产过程，使食品的温度更接近这个范围内它的初始温度。1.160Mpa2.200Mpa（15min）图3.4温度对超高压灭菌（大肠杆菌）的影响有试验表明，果汁在适当温度下加压可以降低酵母、霉菌和一般细菌的致死压力。枯草杆菌等芽孢杆菌的孢子在常温下即使800MPa以上的高压也很难完全杀死，但升温至45-60℃，加压至600MPa即可杀灭。Car1ez等研究了Citrobacterfreundii(用于Salmonellaspp的指示物)在不同温度和压力下的反应，发现在280MPa压力和20℃温度下取得的灭菌效果与230MPa、40℃的灭菌效果相近。芽孢杆菌属和梭状芽孢杆菌属的芽孢对一般加热、杀菌剂和放射线都具较强的抵抗性，同样芽孢对压力的抵抗性也比营养体强得多，如果采用加热和加压合并使用，可以获得良好的杀菌效果，同时也可以相应4降低压力强度。采用单纯加压方式处理不一定是一个有效的途径，而采用温度和压力共同处理则有协同增效作用。因此近几年，随着高压杀菌研究的深入，许多研究者都提出“加压热杀菌”的概念。加压热杀菌可以减少加热时间或降低灭菌所需的高温；同时适当的中温也会减少加压所得的时间和强度。这对于解决孢子的耐热耐压性尤其量要。P.Rovere进行了高压与热处理灭菌效果的模型和计算，主要找出了高压对模拟体系中生芽孢梭菌杆菌的热钝化动力学，指出高压下进行热处理其效果会由于压力作用而放大，如果控制好温度，则可以减少加工时间和加工压力。针对芽孢菌的高耐压性，就现阶段研究来看，结合温度处理则是一种十分有效的杀菌手段。不同的压力与温度组合所取得的杀菌效果差别很大。枯草杆菌等芽孢杆菌的孢子在常温下即使800MPa的高压也难完全杀灭，但升温至45～60oC，加压至600MPa即可杀灭。Reddy等人使用827MPa与40℃对肉毒芽孢杆菌(在磷酸盐缓冲液中)处理lOmin，可使芽孢减少5个数量级。单独加热对嗜热芽孢杆菌芽孢没有明显的杀菌效果，但与超高压协同处理有明显的杀菌效果。有报道称，使用700MPa与90℃对嗜热芽孢杆菌处理30s，可使芽孢减少4.5个数量级。Reddy和Palaniappan报道，在55℃和275～827MPa的范围下，对嗜热芽孢杆菌处理5min，能使芽孢减少3～8个数量级。低温压力协同的效果非常明显。大多数微生物在低温下耐压程度降低，主要是因为压力使得低温下细胞因冰晶析出而破裂程度加剧。蛋白质在低温下高压敏感性提高，致使此条件下蛋白质更易变性，而且人们发现低温下菌体细胞膜的结构也更易损伤。低温对高压杀菌的促进效果特别引人瞩目，因为低温下高压处理对保持食品品质，尤其是减少热敏性成分的破坏较为有利。高桥现二郎等人对包括芽孢菌等常见致病菌在内的16种微生物的低温高压杀菌研究显示，除了芽孢菌和金黄色葡萄球菌外，大多数微生物在-20℃下的高压杀菌效果较20℃下的好。例如在200MPa，20℃下，微生物只死灭1～2次方，但在-20℃下却几乎全部死灭。也有报道葡萄球菌和玫瑰色八链球菌加压290MPa时，0℃处理的要比37℃下处理死灭得早，而在40～50℃以上的高温却未死灭。沙门氏菌在20℃、200MPa的压力下仍有少量存活，当温度为-20℃时，在相同的压力下则全部杀死。也有人指出在5℃的低温下杂菌数会减少的报告，因此5℃以下的低温区就成为加压杀菌注目5的温度。最近又有在200MPa高压下将食品保存在冰点以下温度，观察到杀菌效果增加。例如，面包酵母在室温时必须加压至300MPa以上才能死灭，而在同样条件下，当水相出现冰结晶时，杀菌效果就增强。所以-20～5℃的低温和压力合并应用，同压力与加热合并使用一样有增强作用，而且在-20～5℃的温度下有利于保持食品的风味及其物理性能。温度和压力的拮抗效应但是较低的压力有时对温度条件有拮抗作用。Zobell研究了压力低于100MPa时与温度对微生物影响的相互关系，他认为：a．高压力减弱了高温对微生物的致死效应；b．低温减弱高压力对微生物的致死效应。例如，在对大肠杆菌灭菌时，如温度为46.9℃，压力0.1MPa，死亡率为100%，但当压力变为40MPa时，死亡卒只有26.6%。即压力增大了反而保护了大肠杆菌。压致升温液体在超高压作用下已经不是不可压缩的流体，随着压力的提高，介质被压缩的量增大。液体被压缩过程中会产生热量，形成压致升温。水每提高100MPa，大约可升高3℃。因此在考虑超高压加工的参数时，应该把压致升温计算在内。与传压介质一样，食品基质同样产生压致升温。若食品基质性质与传压介质的相似，可减少热传递的时间，使基质很快达到传压介质的温度，减少热量的损失。水是大部分食品的主要组分，大部分食品表现出的压致升温与水相似，而油、乙醇表现出的压致升温与水不同。因此，需要通过食品基质的组分含量来研究不同食品的绝热升温的幅度。在相同的压力条件下，不同的物料因有不同的可压缩性而表现出不同的压致升温。不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸比较表现出较高的压致升温。橄榄油和大豆油含有多于85％的长链不饱和脂肪酸，牛肉脂肪含有多的长链饱和脂肪酸，而亚麻油酸是多不饱和脂肪酸，这些脂肪分子比较大且没有极性，与之对比，水分子小并且存在极性，水分子由于存在氢键而比脂肪分子压缩更紧密。当对这些组分施加压力时，较疏松的结构有更高的压缩性和得到更大的压缩，因此表现出更高的压致升温。水、脂肪和油的热效应的不同可能是由于它们相应的分子结构和相转变的特6性不同。有报道表明，油表现出最高的压致升温。大豆油、橄榄油和亚麻油酸在增加压力下表