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酶联免疫吸附试验及其应用1二、方法的基本原理和种类ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。由于ELISA法一方面是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因而，具有特异性。而另一方面又由于酶标记抗原或抗体是酶分子与抗原或抗体分子的结合物，它可以催化底物分子发生反应，产生放大作用，正因为此种放大作用而使本法具有很高的敏感性。因此，ELISA法是一种既敏感又特异的方法。常用的ELISA有以下两个方面。(一)测定抗原的，主要有四种方法。1、竞争法（Competitionmethod）:方法的基本原理可见图1：本法首先将特异性抗体吸附于固相载体表面，我们把抗原和抗体吸附到固相载体表面的这个过程，称为包被（Coated），也可叫做致敏。经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液，而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为我们所要测定的未知抗原的量。这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可，因此，对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此法。该法的优点是快，因为只有一个保温洗涤过程。但需用较多量的酶标记抗原为其缺点。图1：竟争法测抗原示意图2、双抗体夹心法,方法的基本原理可用图2来表示酶联免疫吸附试验及其应用2图2.双抗体夹心法测抗原示意图本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入含有抗原之待测样品，如待检样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。我们用在霍乱肠毒素的测定。HbSAg及HbS的测定。3、改良双抗体夹心法：本法是双抗体夹心法的一种改良形式，也是用于测定抗原的，其原理可用图3来表示。图3.改良双抗体夹心法测抗原示意图本法首先是将特异性抗体a包被于固相载体，经洗涤加入含有欲测抗原之待检样品。经孵育洗涤后再加一次未标记的特异性抗体b，而这次加入的抗体b于第一次包被于固相载体上的特异性抗体a对被测抗原来说都是特异性的，但不是用同种动物免疫制备的，否则可出现非特异性反应。经孵育洗涤后，再加酶标记抗b抗体，再经孵育洗涤后加底物显色进行测定。这种方法与双抗体夹心法不同之处是多加了一层抗体。因此，放大的倍数更高，故比双抗体夹心法更加灵敏。同时避免标记特异性抗体，而另一优点是只要标记一种抗抗体，即可达到多种应用。用于测定抗原的尚有第4种叫做抑制性测定法（见图4），它是先用抗原包被固相载体，然后分为二组，一组加入用参考抗体和被检标本混合孵育后的混合溶液，假如标本中不含抗原，则参考抗体未被结合。因此它可以和包被于固相载体上的抗原结合。如标本中含有抗原，则抗原先与参考抗体结合，故参考抗体不再与包被于固相载体上的抗原结合。对加入酶结合物（抗球蛋白）和底物仅显示剩余结合的抗体量。再与另一组不加待检标本的参考系统比较，被检标本对底物显色的抑制程度与标本中所含抗原量成比例，二者之差，即为欲测抗原的量。被检标本对底物显色的抑制程度与标本中所含抗原的量成比例，二者之差即为欲测抗原的量。酶联免疫吸附试验及其应用3图4.抑制性测定法的原理(二)测定抗体方面：所用的方法称为间接法，也是目前最常用的方法，其原理可用图5来表示。图5.间接法测抗体示意图间接法首先用抗原包被于固相载体，这些包被的抗原必须是可溶性的，或者至少是极微小的颗粒，经洗涤，加入含有被测抗体之标本，再经孵育洗涤后，加入酶标记抗抗体，(对人的标本来说即加酶标抗人球蛋白IgG、IgM)，再经孵育洗涤后，加底物显色,底物降解的量，即为欲测抗体的量，其结果可用目测或用分光光度计定量测定，本法用不同种抗原包被固相载体后，只要用一种酶标记抗人球蛋白，即可作多种人的传染病、寄生虫病以及其他疾病的血清学诊断。如用酶标记抗人IgM,则可用于早期诊断。三、ELISA的影响因素（一）固相载体：可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。由于微量反应板所用试剂量少，操作方便，适合于大规模应用。国产聚苯乙烯微量反应板（上海塑料三厂出品）目前已大量应用于ELISA测定，并且获得了满意的结果。但每批微量反应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性能是有显著差别的。实验证明，吸附效果似乎与塑料的类型及其表面性质有关。特别是塑料制品在加工过程中因工艺不同或受其他因素的影响而造成吸附性能的极大差异，甚至完全丧失吸附能力。因此，对每批制品在使用前，必须经过实验室鉴定，鉴定的方法和标准是对每批购置的微量反应板或塑料管抽样，用0.2ug/ml纯化的正常人IgG进行包被，经洗涤后加酶标记抗人球蛋白进行反应，再经孵育洗涤，加底物显色终止反应后，逐孔在酶标比色计中测定其消光值、光密度（O.D值）。一般认为全板中每两孔间O.D值的误差不超过10%为合格。如果中间孔与四周孔O.D值相差太大，或者反应板的这一边与另一边凹孔的O.D值相差大，均不合格。此外，还要检查阳性和阴性参考血清O.D值是否有明显差别。一般要求有10倍左右的差异为合格，微量反应板或塑料管在使用前并不一定通过特殊处理。用蒸馏水冲洗即可应用。（二）抗原：在ELISA中，包被于固相载体表面的抗原或抗体的来源和制备方法对试验结果都有影响。包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和特异性。此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫学活性。经试验证明，适用于其他血清学试验的抗原并非均适合用于ELISA法。因此，对某一疾病的诊断，必须通过实践，才能选出适用的优质抗原。对大多数传染病和寄生虫病的血清学诊断中所用的抗原并非要求十分严格，一般能用于补体结合试验的可溶酶联免疫吸附试验及其应用4性抗原均可用于ELISA，例如超声波抗原、冻融抗原、细菌的外膜抗原、脂多糖（LPS）、细菌的外毒素以及用表面活性剂(如SDS)所提取的抗原等，在作ELISA时，必须要有1-2种试剂、要求纯化，但用表面活性剂提取的抗原在包被前必须透析除去表面活性剂，否则就不易吸附到固相载体上去。此外，对某些抗原必须进行提纯，如病毒的组织培养和鸡胚培养物以及病毒接种动物的脏器等，它们当中存在着许多非抗原的蛋白质，必须设法除去，常用梯度超速离心或亲和层析法提纯，不经提纯是不能使用的。在用特异性抗体包被固相载体时也要提纯。用抗原或抗体蛋白包被固相载体时选择的浓度要适当。如浓度太高，则低效价抗体可能测不出来，或包被过量形成多层抗原吸附，故在操作过程中可能脱落从而降低敏感性和可重复性。用最适稀释度抗原，包被固相载体不仅经济，而且可以克服前带现象。那么用多大浓度抗原进行包被最为合适呢？可通过棋盘滴定法进行测定，但用单项滴定法更为简便，其方法是将抗原进行一系列稀释包被微量反应板，再用一定稀释度的阳性参考血清和阴性参考血清进行孵育后洗涤，再加酶结合物进行反应，经孵育洗涤后，加底物溶液显色，终止反应后分别测定O.D值，选择O.D值≥1.0的那个抗原稀释度为最适包被浓度。一般总是要选择那个O.D值稍大于1.0，而不选择小于1.0的抗原浓度。阴性参考血清O.D值要求0.1-0.2。也就是要求阳性参考血清和阴性参考血清的O.D值有明显差别。抗原包被固相载体除浓度外，对时间、温度、PH均有关系。温度高（如37℃、45℃、或56℃），包被时间可缩短，温度低可延长包被时间。但为了方便起见，通常采用4℃包被过夜，可使抗原吸附得更加完全且均匀。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反应板或塑料管作固相载体时，在碱性条件下（如0.1mol/L、PH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原）4℃包被过夜较为合适。但在某些试验中，如用LPS或毒素蛋白包被时，用PH7.2-7.4PBS稀释才是满意的。包被特异蛋白质的浓度为1-10ug/ml，而对某些病原微生物抗原以5-20ug/ml较为合适，但均应通过滴定。（三）试验样品：血清、血浆或其他体液，均可作为ELISA的试验样品（标本）。但应注意分离血清时，血液要求放置室温中凝固收缩，不宜置冰箱（4℃）中凝固，否则会使大部分IgM和少量IgG丧失活性。关于人血清在保存过程中抗体的稳定性报导尚不多。但一般认为作ELISA血清最好要新鲜，若要贮藏，必须少量分装保存于低温冰箱，并防止反复冻融。血浆可用肝素毛细管法采血，而血清可用滤纸片法采血。被检血清或血浆标本，可用含保护性封阻剂（吐温-20）或称湿润剂的缓冲液来稀释。也可加入一些蛋白质，如1%牛血清白蛋白等来稀释。然后再加到已经用抗原或抗体包被的固相载体中进行孵育。此种被试标本可作一系列稀释度测定，也可用一个稀释度测定。对于作某一个传染病的诊断来说，最好先用一系列稀释度作一批标本测定，求出对诊断有意义的一个稀释度（即测定剂量反应曲线），然后用一个稀释测定即可。最适稀释度和孵育时间均需从实践中摸索出来，对一般病原微生物所引起的传染病的血清学诊断，以1：200稀释度测定比较适当，而试验标本的(即含抗体)作用时间一般为室温或37℃1-2小时。但现在对有些标本（如流脑抗原）测定时，仅用37℃5分钟。对单克隆抗体检测也可缩短作用时间。酶联免疫吸附试验及其应用5（四）结合物：在ELISA中，用酶标记的抗体或抗原统称为结合物，此为进行ELISA检测的关键试剂。常规使用ELISA法的主要问题是能够简便地制备酶结合物，而此种制备好的酶结合物要求稳定，具有很高的酶活性，抗原或抗体的特异性，产量高及成本低。用什么样的酶来标记抗原或抗体呢？可根据以下几点来选择适当的酶。1、酶制品的纯度及活力高，催化效力也高，放大倍数大（即一个酶分子能催化几十几百个底物分子发生反应的酶）。2、酶及制备好的酶结合物在检测或贮存中能保持稳定。3、酶制剂易得、价廉.4、既要适用于标记抗原，又适用于标记抗体，标记后不影响抗原或抗体的免疫学特性，也不降低酶的活性。5、酶的反应产物稳定，检测时简便、快速。在定量测定中产物必须是可溶性的。6、要有安全、价廉、易得的底物。符合上述条件的酶有：碱性磷酸酶，一般用分子量为5×105（AlkalinePhospatase,简称AP），辣根过氧化物酶（HorseRadishPeroxidase,简称HRP,分子量为4×104）,另外尚有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖甙酶，糖化酶及乙酰胆碱酯酶等等。其中以前两种（AP和HRP）最为常用。AP活力高，制备好的酶结合物可加NaN3防腐，但此种酶不易获得，因其是从小牛肠粘膜中或大肠杆菌中提取，而且价格比较昂贵。因此，目前国内外大多使用HRP。HRP活性也高，价格较便宜。但制得酶结合物不能加NaN3防腐。因NaN3能抑制HRP的活性，但可作低温保存或加60%缓冲甘油等量混合后少量分装，保存冰箱，一般可用1-2年。由于HRP最为常用，故先把HRP的一般性质介绍一下，以便在制备酶结合物时可引起注意。(HRP的性质):HRP系从辣根菜的根中所提取，这种酶是无色酶蛋白与暗棕色的铁卟NH2啉（E铁血素）相结合的一种醣蛋白，可简写成Fe-E，由多个（6-7个）同功CH2OH酶所组成。分子量约为40000，等电点为PH7.2。能被58-62%饱和硫酸铵沉淀，在PH3.5-12均较