GB478940坂崎肠杆菌检验20100703

阪崎肠杆菌检验GB4789.40-2010•本标准与GB/T4789.40-2008相比，主要变化如下：•——修改了标准的中英文名称；•——删除了附录A中A.3。2020/1/10Enterobactersakazakii(ES)肠杆菌科肠杆菌属阴沟肠杆菌埃希氏菌属克雷伯氏菌属志贺氏菌属沙门氏菌属……32020/1/10内容第一部分：一般特征第二部分：流行病学特征第三部分：ES的检验42020/1/10第一部分：一般特征一．命名二．培养特征三．生化反应四．抵抗力五．增殖能力六．致病性52020/1/101980年之前一直被称为黄色阴沟肠杆菌。•DNA-DNA杂交•生化反应•黄色素•抗生素敏感性6一、命名2020/1/10二、培养特征•G－无芽孢杆菌，兼性厌氧，在6℃-47℃范围内均可生长，适温35-37℃•营养要求不高：VRBGA、TSA、NA、MAC、EMB、其他与其他常见肠杆菌相似72020/1/10三、生化反应生化反应结果D-山梨醇-产生吐温80脂酶+细胞外Dnase+氧化酶试验-黄色菌落+α-葡萄糖苷酶+89ES及亲缘关系较近的肠杆菌生化反应比较试验生化反应1阪崎肠杆菌阴沟肠杆菌产气肠杆菌成团肠杆菌日勾维肠杆菌赖氨酸脱羧酶－－＋－＋精氨酸双水解酶＋＋－－－鸟氨酸脱羧酶＋＋＋－＋KCN生长＋＋＋v＋发酵:蔗糖＋＋＋(＋)＋卫矛醇－(－)－(－)－核糖醇－(－)＋－－棉子糖＋＋＋v＋D-山梨醇－＋＋v－χ-甲基-葡萄糖甙＋(＋)－－－D-阿拉伯糖醇－(－)＋－＋黄色素＋－－(＋)－注：＋：90-100％；(＋)：75-89%；V：25-74％；(－)：10-24％；－：0-9％第三部分食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验2020/1/10主要内容一、制订的主要依据二、《食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验》11制订的主要依据1.ISO2006年“乳和乳制品中阪崎肠杆菌的检测”（Milkandmilkproducts—DetectionofEnterobactersakazakii）方法；2.美国FDA2002年颁布的“婴儿配方粉中阪崎肠杆菌的分离和计数”（IsolationandEnumerationofEnterobactersakazakiifromDehydratedPowderedInfantFormula）方法；3.2004年荷兰乳及乳制品控制中心对各种阪崎肠杆菌检测方法的比较研究；4.雀巢研究中心2005年环境样品中阪崎肠杆菌快速检测方法；5.阪崎肠杆菌快速检测培养基DFI研究资料。•SN第一部分：分离与计数方法第二部分：PCR方法第三部分：荧光PCR方法2020/1/10常见选择性培养基•DFI(Oxoid,UK)•ESIA(AES,France)•R＆F（R&FLaboratories，Switzerland）•OKmedium•其他：国内阪崎肠杆菌显色培养基、CES(Merck,Germany)，NA+-MUG142020/1/10显色培养基的特点-葡萄糖苷酶活性指示剂：1.5-溴-4-氯-3-吲哚-，D-吡喃葡糖甙（XGlc）2.4-甲基伞形酮--D-葡糖苷（-MUG）3.4-邻硝基苯--D-吡喃葡糖甙152020/1/10162020/1/10选择性培养基的选择1.FDA方法使用VRBGA，ISO方法中使用ESIA，本方法中我们选用DFI。2.ESIA和DFI的基本原理相似，二者都是根据ES能产生α-葡萄糖苷酶，分解底物XaGlc产生有色菌落。3.VRBGA对ES的选择性差，ES、阴沟肠杆菌和成团肠杆菌等多种肠道菌都可以在该平板上生长并产生粉紫色菌落，胆汁酸沉淀形成紫色晕圈。即：不能观察到ES的特征性菌落。172020/1/10显色培养基的选择性较好•DFI对ES的选择性较好，ES形成的蓝绿色特征性菌落易于辨认，而且：1.硫化氢指示剂可以区分ES和产生少量α-葡萄糖苷酶但H2S阳性菌株（如普通变形杆菌）。2.ES都可以在DFI平板上生长并产生蓝绿色菌落3.其他常见菌在DFI平板的菌落颜色a.白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌、泛菌属的多种菌等b.黄色菌落：赫氏埃希氏菌c.黑褐色、粉色或中心蓝绿菌落：少量菌种•ESIA:蓝色，1-3mm182020/1/10选择性增菌肉汤的选择•FDA方法选择EE肉汤，ISO方法选择mLST-Vm，即在LST中加入Nacl和Vm。本标准使用mLST-Vm。•EE肉汤适合所有肠道菌群的生长繁殖，这就可能对ES的生长产生竞争性抑制作用，降低检出率。•研究证明与其他肠杆菌科细菌（如沙门氏菌，大肠埃希氏菌等）相比，ES具有较高的耐渗透压能力。加入0.5M的Nacl在保证ES良好生长的同时，可以有效地抑制上述其他细菌的生长。•Vm可有效地抑制G+菌的生长。而较高的生长温度可以进一步抑制其他细菌的生长。2020/1/10二、食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验202020/1/10本标准修改采用1.ISO/TS22964（1stedition2006-02-01）Milkandmilkproducts—DetectionofEnterobactersakazakii2.FDAJuly2002;RevisedAugust2002IsolationandEnumerationofEnterobactersakazakiifromDehydratedPowderedInfantFormula212020/1/10第一法：阪崎肠杆菌的检验第二法：阪崎肠杆菌的计数222020/1/10第一法阪崎肠杆菌的检验23阪崎肠杆菌检验程序报告生化鉴定挑取黄色菌落DFI琼脂36℃±1℃，24h±2h挑取蓝绿色菌落1mL+mLST-Vm10mL44℃±0.5℃，24h±2h检样100g（mL）+BPW稀释液900mL36℃±1℃，18h±2h前增菌选择性增菌选择性分离生化鉴定100g（mL）2020/1/105.1前增菌和增菌左图：未混合；右图：混合后。25加样入已预热到44℃的BP中2020/1/105.2分离DFI36℃±1℃24h±2h262020/1/10TSA：25℃培养后典型ES：黄色阴性对照E.coliATCC25922：白色菌落27黄色素2020/1/105.3鉴定（生化反应）28生化试验特征黄色素产生＋氧化酶－L-赖氨酸脱羧酶－L-鸟氨酸脱羧酶（＋）L-精氨酸双水解酶＋柠檬酸水解(＋)发酵：D-山梨醇（－）L-鼠李糖＋D-蔗糖＋D-蜜二糖＋苦杏仁甙＋注：＋＞99%阳性；－＞99%阴性；（＋）90%－99%阳性；（－）90%-99%阴性。2020/1/10商业生化鉴定系统的应用•推荐使用的ES生化鉴定方法有很多，主要有API20E，ID32E，BiologGN2MicroPlate，VITEKGNI+等。–上述方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多国家和组织的标准采用。•在肠杆菌的生化鉴定中使用最广泛的是API20E和VitekGNI+。292020/1/10API20E生化鉴定板典型生化反应图示API20E反应编码API20E结果评价3345373Excellentidentification3305173Excellentidentification3305363Verygoodidentification3305373Goodidentification302020/1/10VITEK-GNI+312020/1/10质量控制选择标准菌株作为阳性对照，检测增菌液和分离培养基对阪崎肠杆菌生长的影响和生化鉴定结果，对整个实验的操作过程进行质量控制。322020/1/10第二法阪崎肠杆菌的计数332020/1/103管MPN法342020/1/10SN标准谢谢大家！