Gen-Probe结核分支杆菌检测仪介绍(Bruce)

Gen-Probe分枝杆菌快速检测仪样本显微镜(Ziehl..)敏感性低培养敏感性高2到8周改良罗氏培养基Coletsos液态培养基(MGIT,Bactec,BacTAlert...)鉴定生化检测实验条件苛刻,需数天(Referencecenter)目视检测准确低MTD2.5小时敏感性高–特异性强Accuprobe1小时简单-准确分枝杆菌:用Gen-Probe产品检测程序和时间Gen-Probe检测分枝杆菌试剂类型扩增+杂交检测结核分枝杆菌复合菌:–AMPLIFIEDMTD(Gen-Probe)临床痰标本(涂阳或涂阴)杂交检测分枝杆菌:ACCUPROBEGen-Probe培养阳性标本(菌落或肉汤)MTD(AMPLIFIEDMycobacteriumTuberculosisDirect)检测结核分枝杆菌复合菌:–M.tuberculosis结核分枝杆菌–M.bovis牛分枝杆菌–M.bovisBCG牛分枝杆菌BCG–M.africanum非洲分枝杆菌–M.microti田鼠分枝杆菌–M.canetti卡氏分枝杆菌Gen-ProbeMTD检测以16SrRNA为靶核酸TMA：转录介导扩增HPA：杂交保护分析RNA与DNADNA–非常稳定，在死亡生物内也可存在–双链结构RNA–只存在于活细胞–非常脆弱(RNA容易受破坏)–单链结构结核菌核酸RNA是DNA的4-5倍rRNA占80%Gen-Probe扩增3个主要步骤标本处理释放rRNATMArRNA扩增物HPA检测扩增物超声波裂解样品细胞溶解目标rRNA释放TMA转录介导扩增2条引物：2种酶：*逆转录酶(双功能:逆转录和RNAseH酶)(RNAseH：一种核糖核酸内切酶，特异性水解DNA：RNA杂交链上RNA链的磷酸二酯键，产生5'核苷酸，该酶对单链核酸、双链DNA或双链RNA没有作用)*RNA聚合酶等温扩增：42℃引物1靶rRNARTRTDNARNARNAseH作用DNART引物2DNA模板RNA合成酶RNA扩增物100-1000拷贝RT引物2RNAseH作用RT引物1逆转录酶TMA原理敏感10000拷贝rRNACATATATGCGCATTAATCGTAGCGCGCATATGCTACGTADNARNA聚合酶(eg:E.coli)扩增产物检测：HPA技术HPA：杂交保护分析技术标记丫啶酯（Acridiniumester）的DNA探针与RNA扩增产物杂交，形成DNA：RNA双螺旋结构保护荧光物丫啶酯不被选择试剂淬灭（水解）。AEHPA步骤丫啶酯标记的特异DNA探针与RNA扩增物杂交使用生化水解方法，分离杂交及未杂交探针检测：化学发光检测试剂1：0.001N硝酸中含0.1%过氧化氢；试剂2：1NNaOH杂交AE60℃杂交rRNA探针AEAEAEAEAEAEAE杂交温度的影响60℃61℃59℃AE非特异结合无杂交假阴性高假阳性高选择60℃选择试剂AEAEAEAEAEAEAEAECH3N+OORH2O2/OH-light检测敏感度比较化学发光10-19mole辐射同位素10-18mole荧光10-12mole比色10-9mole总结靶核酸:rRNA等温扩增，2种酶是关键（逆转录酶(RNAseH)、RNA聚合酶）扩增原理：TMA（转录介导扩增）液相杂交：HPA（杂交保护分析）化学发光法：检测杂交信号MTD方法STEP1：标本预处理超声波降解标本STEP2：扩增(TMA)扩增试剂,石腊油，经过预处理的标本-------消化95℃,15分钟，水浴42℃,5分钟--------加入酶试剂，扩增42℃,30分钟STEP3：探测(HPA)加入探针试剂------杂交60℃,15分钟------选择60℃,15分钟------在发光仪读数扩增:TMA加入试管:扩增试剂,石腊油经过预处理的标本消化95℃,15分钟水浴42℃,5分钟加入酶试剂扩增42℃,30分钟标本预处理:准备并（超）声波降解标本探测:HPA加入探针试剂杂交60℃,15分钟选择60℃,15分钟在发光仪读数