genepower生物基因工程专题报告

生物基因工程专题报告深圳源动力生物技术有限公司一、原核基因工程上游技术二、原核基因工程下游技术一、原核基因工程上游技术大肠杆菌表达系统的特点（1）遗传背景清楚，容易审批，例如：Amgen四个由E.coli生产并向FDA注册上市产品，年销售额超过二十亿美元。（2）容易大规模发酵（3）克隆和表达的各种载体和菌株齐全（4）背景文献丰富，上下游配套技术产品齐全（5）易形成包涵体，但近年来研究方向使得大量外源基因能在E.coli里正确折叠，如IL-11、G-CSF、GM-CSF、INF、IL-3、IL-6、Insulin、IL-2等均可获得正确折叠的重组可溶性活性蛋白原核表达系统近年来研究取得突破性进展1998年，美国IncytePharmaceutical公司华裔科学家ZhangYang在《Proteinexpressionandpurification》(vol12,159-165)上发表论文《ExpressionofEukaryoticproteinsinsolubleforminEscherichiacoli》，文章采用E.coli分子内伴侣DsbA技术将IGF-I、IGFBP-3、3Cproteinase、TGF-2、STGF-RII、BDNF、GDNF、mEGFBP、Leptin和GFP十个基因全部实现了可溶性表达，且表达量均大于25%。更为惊奇的是由于DsbA分子伴侣的作用使得拥有9个半胱氨酸的复杂结构的IGFBP-3能在E.coli内形成可溶性具生物活性的高表达重组蛋白。2002年，美国冷泉港实验室出版的《ProteinScience》(2002,11:313-321)上发表了瑞典科学家Torleif《RapidscreeningforimprovedsolubilityofsmallhumanproteinsproducedasfusionproteinsinEscherichiacoli》一文，从而揭开了原核高效快速组合筛选表达系统用于蛋白组学研究的序幕。近年来Medline报导了大量利用原核表达获得有活性的可溶蛋白，现举例如下：GeneExpressionmethodIndexProinsulinDsbAfusionJ.Biotechnol200184(2):175-85htPADsbAcoexpressionApplEnvironMicrobiol199864(12):4891-6BovineenterokinaseDsbAfusionBiotechnology(NY),1995,13(9):982-7MucinMBPfusionProteinExprPurif1999,15(1)146-54HumanangiogeninOmpAsignalBiochemMolBiolInt1999,47(2):267-73BacilluslipaseOmpAsignalApplMicrobiolBiotechnol1998Apr;49(14):405-10HEVantigenThioredoxinfusionZhonghuashiyanhelinchuangbingduxuezazhi2002,16(1):20-2P55TNFreceptorThioredoxinfusionProteinExprpurif2001,23(2)226-32hLH/CGreceptorThioredoxinfusionEndocrine2001,14(2):205-12PokeweedantiviralproteinMBPfusionProteinExprPurif1999,15(1)146-54原核基因表达定位（1）表达的外源蛋白定位于胞内（2）表达定位在胞质膜上（3）分泌外源蛋白到胞周质（4）分泌到胞外培养基（5）表达外源蛋白定位于菌体表面如脂蛋白、外膜蛋白、鞭毛蛋白影响大肠杆菌中外源基因表达的因素1、表达载体的选择2、密码子的选择大肠肝菌偏爱密码子表附后3、翻译起始区4、宿主的选择及培养条件的控制5、折叠酶共表达、分子内伴侣和分泌表达可最大程度地避免包涵体形成。基因表达是一项很复杂的工作，由于特定蛋白可否在大肠肝菌中按需要表达，目前尚无法预知，比较可行的办法是同时试验多种表达方法。基因高效快速表达试剂盒深圳源动力生物技术有限公司代理美国基因动力实验室的原核基因高效快速表达试剂盒将九种表达载体包括分泌型、引导分泌型、胞内直接表达型、分子内伴侣协助折叠型、高度稳定伴侣型等系统的多克隆位点统一，同时统一了诱导表达剂和统一了培养基，一次可以同时克隆九种载体进行表达筛选，极大地节省宝贵的科研时间。其实，象美国Amgen、Gentech、Incyte这类顶尖的生物技术公司也是采用多系统多载体同时筛选快速表达的策略。这一策略的最大优势就是快速且成功率高。本系统非常适合高通量快速筛选大量未知基因，对基因组学和蛋白组学的研究是一个不可缺少的工具。1）冻干菌种可长期稳定保存2）提供详实的操作说明和丰富的参考文献3）下游多种亲和层析组合方便您快速纯化目的蛋白4）分子内伴侣和分泌表达能最大限度避免包涵体形成，直接获得有活性可溶蛋白，这一点对于未知基因功能的研究很重要。5）固相化蛋白酶使您去除融合伴侣十分简便6）九套高效表达载体同时克隆筛选极大地节省您宝贵的科研时间7）T7溶菌酶和lacIq阻遏蛋白能起到严格控制诱导前表达的作用，同时强启动子、高拷贝复制子等方法结合可获得高达50%的表达量。本试剂盒包括冻干菌株、抗生素、统一多克隆位点的九种表达载体等。用户只要扩增出一段不带终止密码子或者带终止密码子的阅读框编码基因克隆进九种表达载体，可同时筛选，节省时间。一般两至三周可以筛选出表达菌株，在此基础上，进一步根据需要进行实验室菌株的优化从而成为工程菌株。目的基因的扩增和酶切位点的选择1）本试剂盒选用了统一的多克隆位点为GGATCCGCAGAATTCAGCGCTAGCCAC（TAA）CATCATBamHIEcoRINheIHisHisHisCATCATCATTAAGCTTHisHisHisHindIII我们建议您扩增基因5端选BamHI或BglII，3端选NheI或XbaI或SpeI，同时3端不要带终止密码子，注意与GGATCC（GlySer）表达框架正确，载体用NheI—BamHI双酶切。BamHI和BglII为同裂酶，NheI、XbaI和SpeI为同裂酶。如您目的基因无法满足上述要求，如同时含有BamHI和BglII，5端可选择EcoRI，但须注意与表达框架GAATTC（GluPhe）对齐。如您目的基因同时含有XbaI、NheI和SpeI，3端可选择EcoRI。如果您的目的基因已带有终止密码子，同样可以进行克隆表达，只是注意有些表达载体是在C端带6个His。PCR引物设计时BamHI和EcoRI位点的5端保护碱基有2至3个GC即可，而XbaI、NheI和SpeI位点5端保护碱基须在5个左右才容易被酶切割。本试剂盒采用的技术路线如下：您提供的基因ORF九种表达载体克隆诱导（小样）SDS—PAGE分析筛选出表达菌株发酵（中样）亲和层纯化融合蛋白固相化蛋白酶柱或液相切割目标蛋白pLLP—OmpA表达载体采用E.coli强启动lpp和OmpA分泌信号肽，同时在C端添加了6个His可采用chelatingsepharose亲和层析纯化目标蛋白。该表达载体成功地实现过人生长激素的基因工程工业化，经多年临床验证，分泌型重组人生长激素临床副反应大大低于包涵体型的重组人生长激素。pLLP—STII表达载体采用E.coli强启动lpp和STII分泌信号肽，同时在C端添加了6个His便于采用chelatingsepharose亲和层析纯化目标蛋白。STII信号肽引导能力强且易于被E.coli信号肽酶切割。即使第一个氨基酸是半胱胺酸的干扰素也可以实现分泌表达。pMBP—P表达载体采用E.colitac启动子和分泌型麦芽糖结合蛋白（maltosebindingprotein）同时选用凝血酶切割位点并在C端添加6个His便于采用chelatingsepharose亲和层析纯化目标蛋白。该表达系统在Medline里有大量的背景文献参考。它通过MBP引导分泌，可以实现许多基因在周质空间里正确折叠，如TPO（1-153aa）、GM—CSF、IL—2等。我们采用这一表达系统配合固相化的凝血酶成功地获得了正确折叠的rhGM—CSF，临床试用表明其副反应比包涵体型rhGM—CSF大大降低。该表达载体表达的蛋白还可通过Amylose亲和层析。pMBP—C表达载体采用E.colitac启动子和胞内可溶性麦芽糖结合蛋白（maltosebindingprotein），同时选用凝血酶切割位点并在C端添加6个His便于采用chelatingsepharose亲和层析纯化目标蛋白。该表达系统在Medline里有大量背景文献参考。它通过MBP胞内融合表达，表达产物可占菌体的20%—30%，可形成可溶性蛋白，也可形成包涵体。融合蛋白还可以通过Amylose亲和层析纯化。pET—GST表达载体采用T7启动子和GST融合表达，同时选用人鼻病毒14亚型3C蛋白酶专一性切割位点。本公司有高纯度的重组人鼻病毒14亚型3C蛋白酶出售，同时还有专一性吸附该蛋白酶的树脂出售。此外，C端还添加了6个His，便于采用chelatingsepharose亲和层析。本载体表达的融合蛋白可采用吸附GST的亲和层析和6个His的chelatingsepharose双重亲和层析，极大地方便了下游纯化。GST融合表达背景文献在medline里极为丰富，有数百个基因采用GST融合表达成功。pET—Trx表达载体采用蛋白质工程改造的硫氧还蛋白即将其中两个氨基酸突变成His，使硫氧还蛋白在空间立体结构上形成三个组氨酸位点（His-patch），便于采用chelatingsepharose亲和层析。该表达载体采用T7启动子和（His-patch）Thioredoxin融合表达，同时选用人鼻病毒14亚型3C蛋白酶专一性切割位点。硫氧还蛋白作为分子内伴侣可以帮助许多基因在E.coli胞内正确折叠如IL—3、IL—6、IL—11等。pET—His表达载体采用N端6个His和T7启动子。高效表达的产物N端具备6个His，便于采用chelatingsepharose亲和层析纯化目标蛋白。同时该载体选用了凝血酶专一性切割切点。融合蛋白既可以采用高纯度限制级的冻干凝血酶（本公司有售）液体切割，也可以采用固相化凝血酶（Sigma有售）切割。pTrc—CKS表达载体采用T7启动子和蛋白质工程改造过CKS基因融合表达，同时选用人鼻病毒14亚型3C蛋白酶专一性切割位点。CKS融合表达是美国Abbot公司的专利，CKS融合蛋白研制成功HIV和HCV重组抗原并取得FDA认证在美国上市。CKS是一个非常稳定且高度可溶的理想伴侣。本发明除去掉CKSC端8个氨基酸外，还将C端Met突变成Thr，一方面可报自已的专利，另一方面有利于基因表达。pET—DsbA表达载体采用T7启动子和DsbA基因融合表达，同时选用凝血酶切割位点。DsbA是近年来发现帮助二硫键形成的重要分子内伴侣之一。本试剂盒DsbA基因去掉了信号肽，同时将DsbA氧化还原功能相关的两个半胱氨酸（cys）突变成丝氨酸（ser），这样与突变后的DsbA融合可实现许多基因的胞内可溶性有活性的高表达（表达量大于30%），如IGF—1、IGFBP、EGF、Insulin等。本试剂盒还将两种E.coli菌株冻干方便长期保存。成功客户案例----汕头大学医学院肿瘤病理室李恩民、许艳丽老师课题组承担国家863课题食管瘤相关癌基因的研究。该课题组获得肿瘤相关基因NGAL，希望能表达分离出蛋白以进一步研究其功能。课题组曾使用过Qigen公司PQE载体和6His-tag蛋白纯试剂盒、pharmcia公司pGEX(GST融合)和Novagen公司的pET15b等载体，用了近一年时间均未获得成功。原因均为包涵