GST-pulldown

GST-pulldown实验一、实验所需试剂及配制：1、LB培养基成分：1%（W/V）Tryptone5%（W/V）YeastExtract1%（W/V）NaCl步骤：（1）称取下列试剂，置于1L烧杯中：Tryptone10g；YeastExtract5g；NaCl10g（2）加入约800ml去离子水，充分搅拌溶解（3）滴加NaOH调节PH值至7.0-7.2（注：1L培养基约需5MNaOH1ml）（4）加去离子水定容至1L（5）高温高压灭菌后，4℃保存。2、LB/Amp培养基配制成分：1%（W/V）Tryptone5%（W/V）YeastExtract1%（W/V）NaCl0.1mg/mlAmp（氨苄青霉素）步骤：（1）--（5）同上（6）高压后，温度降至60℃以下，加入1LAmp（100mg/ml）后均匀混合，4℃保存。（注：高压后直接加入，温度过高易使抗生素灭活）3、Amp（100mg/ml）配制：步骤：（1）称量5gAmp置于50ml离心管中（2）加入40ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50ml（3）用0.22um过滤膜过滤除菌（4）小分分装（1ml/分）后，-20℃保存。4、LB固体培养基配制：成分：1%（W/V）Tryptone5%（W/V）YeastExtract1%（W/V）NaCl15g/L琼脂糖粉步骤：（1）同LB培养基称取上述试剂充分混匀后并调PH值（2）高压灭菌后，等待培养基冷却至50-60℃，加入抗生素，摇匀（3）超净台中均匀铺板，待冷却凝固后，4℃密封保存（注：每个板子大约需要25ml培养基）二、目的质粒转化大肠杆菌、菌种挑取及保存（一）转化1、-80℃冰箱中取感受态细菌（15ul），冰上解冰。2、加入质粒DNA溶液（5ul），轻摇匀，冰上放置30min。3、42℃水浴中热击45s，促使细菌吸收质粒，热击后迅速置于冰浴冷却2min。4、将其转移到预先加入600-800ulLB液体培养基（不含抗性）的离心管中，混匀后，37℃震荡培养1h（使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因）。5、吹匀菌体，涂布于含抗性的固体筛选培养皿上，于37℃温箱正面向上放置30min，待菌液完全吸收后倒置培养皿，继续培养12-16h。（二）挑菌、保存1、挑菌：在LB固体培养基中挑出单个菌落（不能成簇生长），用10ul枪头或者牙签挑取菌落，菌落吹散装入含有LB培养基（4-5ml,含Amp）的离心管中，于37℃摇床150rpm摇菌7-8h。其余可保鲜膜密封保存于4℃。（注：摇菌时摇菌管瓶盖应松口，并用胶带适当固定防脱落）2、摇菌生长7-8h后，细菌多处于生长期，可进行细菌大量扩增，也可在此状态保存菌种。菌液保存条件：甘油：菌液=2:8，-80℃保存（注：一般每次保存1ml）三、细菌扩增、GST融合蛋白制备1、小摇：分别取含有PGEX-PAK、PGEX-2T质粒的E.coliBL-215ul，加入5mlLB/Amp培养基中，37℃，150rpm，6-8h，小摇复苏。2、大摇：取适量的小摇复苏的菌液，按菌液与LB/Amp培养基1:1000的比例，37℃，100rpm，过夜培养3、诱导：各瓶加入适量IPTG诱导蛋白表达（注：1M的IPTG1:2000使用，24g/ml的IPTG1:500使用），28℃，130rpm，继续培养3h（注：一般大摇和诱导表达的总时间不应超过12-14h）4、离心：诱导后的菌液收集于50ml离心管中，4℃，2800rpm，离心30min，弃上清。采用3ml/50ml细菌裂解液（1*PBS，1%TritonX-100）重悬菌体沉淀,每管1ml分装。（注：根据细菌生长情况，也可以1ml/0.1g湿菌）5、碎菌：超声裂解细菌（3*10秒/管），4℃静置10min，后13000rpm离心10min转移上清至1.5ml离心管中。6、Beads（结合）：各管加入40ul谷胱甘肽亲和纯化球珠(glutathione-Sepharose4Bbeads),4℃孵育过夜7、将过夜的Beads4℃，7500rpm,5min离心;小心弃去上清;8、用1mlPBS液重悬沉淀;7500rpm,4℃离心5min;小心弃去上清;重复此步操作4次.9、各管的Beads加入70ul1*LoadingBuffer，电泳考马斯亮兰染色观察融合蛋白的表达水平。其余各管离心后取沉淀，准备与细胞理解液孵育。四：裂解肺炎衣原体感染的平滑肌细胞衣原体感染后的平滑肌细胞，加入300-400ul的细胞裂解液，冰上裂解后收集，13000rpm，4℃,10min离心，取上清，并测定蛋白浓度。五：GST融合蛋白与细胞裂解液孵育1、取一管Beads并离心后的沉淀，根据测定的蛋白浓度，加入约1.0mg相应体积的蛋白裂解液，4℃孵育4-6h。2、孵育后的珠子4℃，1000rpm,5min离心，小心弃上清，用1mlPBS重悬沉淀，重复4次。离心四次后，小心吸干净上清，加入70ul1*Loadingbuffer，100℃，煮沸10min，冰上放置5min，重复一次，使珠子、GST融合蛋白、Rac1-GTP充分分离3、制胶、上样Westernblot实验检测Rac1活性（注：Rac1分子量小，选择使用12%分离胶）