G蛋白偶联受体激酶的研究进展

1G蛋白偶联受体激酶的研究进展摘要：G蛋白偶联受体激酶(GRKs)是一簇与G蛋白偶联受体(GPCRs)失敏相关的激酶。GRKs的主要功能是介导GPCRs磷酸化，并与抑制蛋白arrestins协同作用促进GPCRs内化和与G蛋白失偶联，从而导致GPCRs的失敏。关键词：G蛋白偶联受体激酶；G蛋白偶联受体；抑制蛋白；失敏；内化G蛋白偶联受体激酶(Gprotein-coupledreceptorkinases，GRKs)是一簇与G蛋白偶联受体(GPCRs)快速失敏(desensitization)相关的激酶。许多GPCRs如阿片受体、血栓素受体、5一羟色胺受体、肾上腺素能受体等在激动剂持续刺激时易发生转导信号的快速衰减，发生机制主要与3类调节分子即GRKs，抑制蛋白arrestins和第二信使调节激酶，如PKA，PKC有关。其中以GRKs最为引人关注。1GRKs的结构和功能GRKs家族由7个结构上有同源序列的家族成员组成[1]。每种GRKs都含有共同的功能结构，包括1个中心催化区、1个底物识别和含有G蛋白信号调节蛋(regulatorsofGproteinsignaling，RGS)样结构的氨基末端区，以及1个作用于胞膜的羧基末端区。根据序列和功能的相似性可分为3个亚家族。第一个亚家族包括GRKl和GRK7。GRKl是视紫质(rhodopsin)激酶，仅在视网膜光受体细胞表达，作用底物是视网膜的视蛋白。人GRK7基因位于3q21，长度约10kb，由4个外显子组成。人GRK7仅在视网膜表达，包括所有的视网膜神经元和锥体外节段。重组的人GRK7在光照条件下可催化视紫质磷酸化。有实验证实，GRKl和GRK7在人视锥细胞均有表达；与此相反，GRK7在小鼠的许多组织包括视网膜均有表达，而视网膜的光受体则不表达GRK7。人锥体外节段表达GRK7而小鼠不表达，提示GRK7可能为GRKl基因缺失的小口氏病(一种夜盲症)患者提供正常的光觉[2]。第二个亚家族的GRK2和GRK3又分别称为β-肾上腺素能受体激酶1(β-ARKl)和β-肾上腺素能受体激酶2(β-ARK2)。Oppermann等[3]将GRK2，GRK3的单抗加入家兔心肌细胞，结果异丙肾上腺素诱导的受体磷酸化77％受到抑制；而GRK4的单抗却无抑制作用。鸡神经元细胞可表达GRK3样蛋白，细胞内注入GRK2或GRK3的特异性单抗，结果消除了α2一AR介导的钙流抑制失敏。第三个亚家族包括GRK4，GRK5和GRK60。GRK4仅在睾丸高水平表达，提示该2酶具有底物的特异性。GRK5和GRK6是两种相关激酶，它们与另外两种激酶GRK2和GRK3一样在全身各处均有表达。该亚家族成员的作用底物更广，并具有重复的底物特异性。2GRKs与GPCRs失敏受体失敏的程度可以是信号的完全终止，如视觉和嗅觉系统即如此；也可以是激动剂效力的减弱，如β2-AR[4]。受体失敏的程度受许多因素包括受体的结构和细胞环境的影响，主要特征是受体与异三聚体的G蛋白失偶联。当然，GPCRs信号转导的终止也可发生在G蛋白水平，如RGS家族成员可以增加与Gi，Gq亚基结合GTP的水解，从而减弱通过Gi和Gq转导的信号[5]。受体未活化时，GRKl～3存在于胞浆；受体活化后，GRKl-3转移至胞膜并与目的受体结合。钙感受器蛋白recoverin可调节GRKl的活性，但对GRK2～6的活性无调节作用。虽然GRK2和GRK3没有异戊二基化，但这些激酶的活性仍部分受异三聚体G蛋白亚基的调节。GRK2，GRK3与G蛋白亚基间的作用是由激酶羧基末端125个氨基酸的亚基结合区介导的，该区的氨基酸序列与血小板-自细胞．C激酶底物(pleck-strin)同源区十分相似。GRK2羧基末端结合区的过量表达影响内源性GRK2的膜向移位，其机制可能是对游离G蛋白亚基有扣押作用。已有人用该区表达产物在培养细胞和转基因小鼠阻断GRKs介导的失敏[6]。4，5-二磷酸磷酯酰基醇与羧基末端pleckstrin同源区的结合，也对该酶的膜向移位有影响。最近证实，分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)导致的GRK2羧基末端磷酸化，可减低GRK2与GPCRs底物的结合[7]。与之相反，PKC引起的丝氨酸磷酸化和c—Src引起的酪氨酸磷酸化则可增强GRK2活性和膜向移位。因而GRK2的活性受一系列复杂的蛋白磷酸化调节。在GPCRs未受激动剂活化的条件下，GRK4，GRK5和GRK6也表现出膜向定位。GRK4和GRK6的棕榈化发生在羧基末端的胱氨酸残基[8]，棕榈化对它们在胞膜定位具有重要意义。棕榈化的GRK4和GRK6已从胞膜分离获得。另外，在β2-AR磷酸化过程中，棕榈化GRK6的活性是非GRK6的10倍[8]。由于蛋白棕榈化是一种可逆性的翻译后蛋白修饰，GRK4和GRK6棕榈化的动态变化对这些激酶的功能活性有重要影响。GRK5与胞膜间的作用目前认为是通过该激酶含46个氨基酸残基的羧基末端与质膜磷脂间的静电作用介导的。GRK5的活性不仅受该酶羧基末端丝氨酸、苏氨酸3残基磷酸化影响，也受该酶与膜磷脂作用的影响。与GRK2不同，PKC介导的磷酸化会减低GRK5的活性。3GRKs与抑制蛋白GRKs介导的视紫质或β2-AR磷酸化尚不足以使这些GPCRs全部失活，GPCRs失活还需要其它抑制剂的参与。第一种抑制蛋白是在视杆外节段获得鉴定的，分子量为48kD，现在称为视抑制蛋白(visualarrestin)。已证明它能与光活化的视紫质结合。另一种视抑制蛋白样蛋白称为β-抑制蛋白1，它是体外GRK2介导β2-AR失敏所需的辅助因子。已克隆的β-抑制蛋白1与视抑制蛋白有59％的序列同源性。抑制蛋白参与GPCRs失敏的机制包括GPCRs与异三聚体G蛋白失偶联(视抑制蛋白和β-抑制蛋白均可引起)和GPCRs的内化(β-抑制蛋白引起)。至今已发现4种抑制蛋白家族成员。根据序列同源性、功能和组织分布可将其分为两类：①视抑制蛋白(S抗原)和锥抑制蛋白(X-抑制蛋白或C-抑制蛋白)。②β-抑制蛋白(β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2)。可能还存在第三簇的抑制蛋白，因为已有部分D-抑制蛋白和E-抑制蛋白cDNA克隆的报道。视抑制蛋白是视杆外节段一种主要的蛋白成份，主要存在于视网膜，在松果腺有少量表达[9]。C-抑制蛋白在视网膜和松果腺均有高表达，但主要存在于视网膜锥体光受体。牛视抑制蛋白含404个氨基酸，并有两种变异多肽。一种变异体(p44)的最后35个氨基酸残基被一个丙氨酸残基所取代；另一种变异体缺乏由外显子13编码的338～345氨基酸残基[9]。p44视抑制蛋白变异体特异性地定位于视杆外节段，它对视紫质潜在的抑制性是正常视抑制蛋白的数倍。这样，正常视抑制蛋白羧基末端区与视紫质结合就显得不那么重要了，这个推断已获得证实[10]。视抑制蛋白羧基末端区是与其它同分异构体相互区别的特征性结构。β-抑制蛋白在视网膜以外有广泛表达，但以神经组织和脾脏表达丰富。大鼠中枢神经系统β-抑制蛋白2的表达较β-抑制蛋白1丰富。β-抑制蛋白存在于几种神经通路，免疫电子显微镜观察发现β-抑制蛋白与GRKs一样主要集中在神经原的突轴，以便调节神经原的功能。与视抑制蛋白相似，β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2至少各有一种变异体表达。β-抑制蛋白1的变异体在第333和334之间插入了8个氨基酸残基；β-抑制蛋白2的变异体则在第361和362之间插入了11个氨基酸残基。β-抑制蛋白与变异体间是否存在差异，未见报道。抑制蛋白结合4的对象是被激动剂激活和GRKs磷酸化的GPCRs，以拮抗第二信使调节激酶的磷酸化和非磷酸化的受体。在体外GRKs磷酸化使β-抑制蛋白与β2-AR结合的亲和力增加10～30倍。视抑制蛋白与视紫质的结合的亲和力甚至更高。GRKs磷酸化发生在第三个细胞内环区(如m2mAChR)或受体的羧基末端(如视紫质和β-2AR)。这样，要结合并阻断不同GPCRs亚型的信号转导，抑制蛋白必须识别并与不同受体的特异区域结合。支持这种观点的证据有：①视抑制蛋白与视紫质问的相互作用可被代表视紫质细胞内第一和第三环合成肽阻断；②β-抑制蛋白可与m3mAChR和5-羟色胺2A受体的细胞内三环区共免疫沉淀；③β2-AR羧基末端并非β-抑制蛋白结合所必须。Gurevich等检验了几种抑制蛋白与不同功能形式的视紫质、β2-AR和m2mAChR的结合力。虽然每种抑制蛋白异构体均表现出与GRK磷酸化激动剂活化的受体结合，但同时也能与非激动剂激活磷酸化和激动剂激活非磷酸化受体结合。唯有视抑制蛋白例外，它只选择性地与GRK磷酸化和光活化的视紫质结合。视抑制蛋白的分子结构可分为3个功能区和2个调节区。功能区包括：一个受体活化识别区(氨基酸残基24～180)、一个受体活化第二识别区(氨基酸残基180～330)和一个磷酸盐感受区(氨基酸残基163～182)。调节区由一个氨基末端调节区(氨基酸残基1～24)和一个羧基末端调节区(氨基酸残基330～404)构成。视抑制蛋白有两个主要的功能区，每个功能区为7条绳状的三明治结构[11]。通过突变分析可知，这两个区即N区(氨基酸残基8～180)和C区(氨基酸残基188～362)分别构成受体活化识别区和第二受体识别区。视抑制蛋白羧基末端尾部(氨基酸372～404)由一个韧性的连接器(flexiblelinker)与C区相连，羧基末端与抑制蛋白的N区和C区形成不同的作用形式来调节它们的结构。诱变研究证实，磷酸盐感受器构成一个极性核，其基础状态下埋植于N区与C区间形成抑制蛋白分子的支点。核结构在抑制蛋白的亚型中可能是一个高度保守的结构。氨基末端和羧基末端调节区的残基(Asp-30和Arg-382)也参与了视抑制蛋白极性核的构成。从视抑制蛋白的诱变研究和晶体结构推测，羧基末端与极性核问的相互作用稳定了视抑制蛋白的基态结构[25]。但与受体结合后，磷酸化受体尾部侵入极性核，因而破坏了极性残基并释放出羧基末端的尾部。这就导致N区和C区沿极性核形成的支点重新定向，有利于受体．抑制蛋白复合物的形成[11]。4GPCRs内化5受体内化也称作活化受体的细胞膜内扣押，GPCRs内化已成为近年研究的热点。观察发现，肾上腺素能激动剂处理后，蛙红细胞表面肾上腺素能受体识别位点丢失。细胞表面和内化β2-AR结合位点可以通过它们在蔗糖梯度中不同的沉降率或它们的亲水和疏水性配基加以区别[12]。内化受体存在于胞膜的轻泡组分(“lightvesicular”fraction)，而细胞表面受体则存在于胞膜的重泡组份(“heavyvesicular”fraction)；同样，内化β2-AR易与疏水配基结合而不易与亲水配基结合[12]。近来通过受体表位标记的免疫组化染色证实，激动剂活化后细胞表面β2-AR发生重新分布，这种结果在活细胞中通过绿色荧光蛋白(GFP)标记的β2-AR同样得以证实[13]。已在几种不同GPCRs进行过类似的实验，结果表明GPCRs的内化率具有不同的受体特异性。例如A1腺苷受体内化(tl/2=90min)就比A3腺苷受体内化(tl/2=19min)慢[l4]。这些动力学差异提示GPCRs内化可能由多种胞吞(endocytosis)机制介导，或者说受体亚型问的异质性调节着它们与胞吞衔接器蛋白(endocyticadaptorproteins)结合的亲和力。Sibley等首次提出了受体磷酸化可能参与GPCRs胞吞。然而当对该假设进行实验验证时发现，缺乏第二信使调节蛋白激酶和GRKs介导受体磷酸化位点的β2-AR突变体，与野生型的内化无明显差异。PKA和GRK抑制剂处理A431细胞也得出类似的结果。由此推论，受体磷酸化不是GPCRs胞吞过程所必须的。磷酸化最先认为在β2-AR内化中起一定的作用，但也参与了其它GPCRs的胞吞，如m2mAChR。早期实验证实，受体第三环区丝氨酸和苏氨酸残基突变可减少m2mAChR内化。Tsuga等证实野生型GRK2的过度表达可增加m2mAChR内化率和最大程度，而COS7细胞非显性GRK2突变体(K