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乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒时间分辨免疫荧光分析法标准操作规程内江市白马中心卫生院医院文件编号1编写者陈德森审核者杭立新批准者王义英医院：内江市白马中心卫生院科：检验科室：免疫室乙肝病毒e抗原诊断试剂盒时间分辨免疫荧光分析法标准操作规程版本：第一版执行日期：2013年6月共3页第1页1.原理HBeAg试剂盒(IFMA法)是双抗体夹心时间分辨免疫荧光分析法，采用多克隆抗-HBeAb包被反应板，用铕标记单克隆抗-HBe，加入待测样本后，样本中HBeAg与已包被在板上的多克隆抗体结合成抗-HBe-HBeAg复合物，再加入铕标记物抗-HBe-DDTA-Eu后，与已结合在板上的HBeAg联接成抗-HBs-HbeAg-抗-HBe-DDTA-Eu复合物。增强液(β—NTA)将复合物上的Eu3+离子解离到溶液中，并与增强液有效成分形成高荧光强度的螯和物，荧光强度和样品种的HBeAg浓度成正比。通过测定荧光强度，测定血清样本中的乙型肝炎病毒e抗原。2.样本处理血液样本尽快送实验室，室温下离心分离出血清，置于洁净离心管中保存。3.试剂本科室使用苏州新波生物技术有限公司乙肝病毒e抗原（HBeAg）时间分辨免疫荧光法诊断试剂盒，试剂盒主要组分如下：a.阳性对照：I瓶(1m1)b.阴性对照：1瓶(1m1)c.铕标记物：1瓶(0.2m1)，使用前按需求量做1：100倍稀释d.铕标记稀释液：1瓶(20m1)e.浓缩洗液：1瓶(40m1)，使用前用去离子水做1：25倍稀释f.增强液：1瓶(20m1)g.微孔反应板：一块(12*8，包被有抗-HBs的单克隆抗体)h.吸头：20支i.封片：3片(封板用)j.说明书：I份k.线性参比品：1份医院：内江市白马中心卫生院科：检验科室：免疫室乙肝病毒e抗原诊断试剂盒时间分辨免疫荧光分析法标准操作规程版本：第一版执行日期：2013年6月共3页第2页4.仪器（用户自备）4.1时间分辨荧光分析仪；4.2微孔洗涤机；4.3微孔振荡器；5.操作步骤5.1试剂的准备：将浓缩洗液做1：25倍稀释，作为工作洗涤掖；使用前一小时内将铕标记物按所需量1：100倍稀释并一次用完（使用一次性的塑料容器来配制）。5.2将试剂及所需数量的微孔反应条置室温(20—25℃)平衡。5.3取100ul的阴，阳性对照及待测样本，按顺序加入微孔反应条小孔中并加贴封片。5.4在室温下，用振荡器缓慢震荡孵育l小时。5.5在第一次孵育结束后，用微孔洗涤机洗涤4次后拍干。5.6每孔加入100u1已稀释的铕标记物工作液，并加贴封片。5.7同操作步骤5.4。5.8第二次孵育结束后，重复用微孔洗涤机洗涤6次后拍干。5.9每孔中加入增强液100u1(加样过程中避免碰到小孔边缘或其中的试剂，尽量避免污染)，并加贴封片。5.10微孔反应条用振荡器轻摇5分钟，检测(在半小时内完成)6.计算6.1CUTOFF＝COUNTS(阴性对照)×2.1，如果被测标本的荧光计数值(COUNTS)与CUTOFF的比值≥l.0，则判断为阳性，否则为阴性。6.2如果阴性对照的COUNTS值低于2250，按2250计算，如果阴性对照的COUNTS值高于2250，按实际计数值计算。7．临床意义HBeAg是乙型肝炎传染性的标志，检测HBeAg有助于判断HBsAg携带着传染性强弱，母婴传播的危险率及急性乙型肝炎的预后等，HBeAg消失和抗-eAg出现显示乙型所炎病情的好转，但不能作为无传染性的指标，也不一定是对机体有益的标志(AFP与抗-HBe有相关性)。医院：内江市白马中心卫生院科：检验科室：免疫室乙肝病毒e抗原诊断试剂盒时间分辨免疫荧光分析法标准操作规程版本：第一版执行日期：2013年6月共3页第3页8．参考值0.03NCU／m19．注意事项9.1理解说明书，不要混用不同批号的试剂，不要使用过期的试剂。9.2尽量建立一个干净无尘的实验室环境，对实验的成功起到决定性作用。(因为尘土中含有很多金属离子，会影响实验结果)。9.3试剂盒与被测样本使用前必须达到室温。9.4振荡器按照《2510变频振荡器标准操作规程》设定需要的振荡频率。9.5洗板机在每天使用前应进行校正注液量和残自量．注意管道是否畅通。洗涤时，确认每孔必须是干的洗涤液都注满微孔．波涤后，每个孔必须是干的．如果仍有水则需拍干。9.6吸取增强液和铕标记物时，请使用干净的吸头，避免尘土等不必要的污染。加增强液时探头应悬空，避免碰到小孔边缘或其中试剂。9.7使用医用蒸馏水或去离子水配制洗液。9.8宜用干净的一次性容器配制铕标记物，应避免铕标记稀释液进入标记物原液中。9.9封片不能重复使用。9.10如需稀释标本，请用小牛血清稀释。9.11所有的样本和本试剂盒应作为潜在的传染原看待，按传染病实验室检查规程操作。9.12如对实验结果有疑问，应重复试验。9.13胆红素800umol/L，甘油三脂20mol/L，血红蛋白18g/dl对本试剂盒无干扰作用。9.14本试剂盒应置2—8℃保存，以产品批号日期起有效期为一年。