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新乡医学院实验课教案首页课程名称：微生物学授课教师姓名及职称：丰慧根教授一、授课题目实验一细菌的简单染色和革兰氏染色二、授课对象2005级生物技术专业本科生三、实验教学目标与课时分配1、学习微生物涂片、染色的操作技术；2、掌握细菌单染色和革兰氏染色的方法；3、初步掌握无菌操作技术；4、掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。3课时四、授课重点1、微生物涂片、染色的基本技术；2、无菌操作技术五、授课难点1、微生物涂片、染色的基本技术；2、无菌操作技术六、授课形式实验课讲授七、授课方法与课前准备授课方法：启发式教学，讨论式教学；课前准备：做预实验，准备示教材料，写教案八、教材与参考文献沈萍、范秀荣、李广武主编。《微生物学实验（第三版）》，高等教育出版社。九、思考题1．你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？2．当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？十、教研室主任及课程负责人签字教研室主任（签字）课程负责人（签字）年月日年月日1新乡医学院实验课教案课程名称：微生物学任课教师：丰慧根教授基本内容教学手段和教学组织细菌的简单染色和革兰氏染色一、实验目的1、学习微生物涂片、染色的操作技术；2、掌握细菌单染色和革兰氏染色的方法；3、初步掌握无菌操作技术；4、掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。二、实验内容和原理细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体着色，与背景形成鲜明的对比，以便在显微镜下进行观察。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等，本实验主要做前面两种。（一）简单染色法原理：这是最基本的染色法，由于细菌在中性环境下一般带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫进行染色。简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。强调实验课的要求和规则简单复习理论知识过渡到本实验目的结合理论知识讲解实验原理2（二）革兰氏染色法原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法是细菌学上最常用的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色过程所用四种不同溶液和作用：1、碱性染料：这在简单染色中已讨论过，此处用结晶紫。2、媒染剂：其作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。常用的媒染剂是碘液。3、脱色剂：帮助染料从被染色的细胞中脱色。利用细菌对染料脱色的难易程度不同，而将细菌加以区分。革兰氏阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰氏阴性细菌则易被脱色。常用的脱色剂是丙酮或乙醇，这里所用的是95%的乙醇。4、复染液：也是一种碱性染料，目的是使脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未脱色菌进行比较。这里用的是蕃红花红溶液。近年来由于对细菌细胞壁的结构有了较深入的了解，对革兰氏染色的机制提出不同的看法。一般认为革兰氏阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰氏阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。虽然如此，革兰氏染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰氏染色阳性反应。三、实验器材1、活材料：培养12-16h的枯草杆菌（Bacillussubtilis），培养24小时的大肠杆菌（Escherichiacoli）2、染色液和试剂：草酸铵结晶紫染液、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红染液、复红、乙醚酒精溶液、香柏油、无菌水3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。简单介绍本次实验所用器材3四、实验方法1、简单染色：（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴无菌水，按无菌操作法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，并涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2，左边涂枯草杆菌，右边涂大肠杆菌。注意取菌不要太多，图片要均匀。（2）干燥：让涂片自然晾干。（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏。（染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。）（4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加草酸铵结晶紫染液1-2min。（5）水洗：倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止。（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。（7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。2、革兰氏染色：（1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。（2）晾干：与简单染色法相同。（3）固定：与简单染色法相同。（4）结晶紫染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。（5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。（6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。（7）水洗：用水洗去碘液。（8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20-25s至流出液无色，立即水洗。（9）复染：滴加蕃红复染2min。重点介绍制片方法，强调无菌操作边讲解边演示,并强调实验注意事项通过提出问题加强学生对实验原理的理解4（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。（11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。（12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。（13）实验完毕后的处理：①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净：a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去；b.用擦镜纸沾少许乙醚酒精溶液将镜头擦2-3次；c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。五、注意事项1.载玻片要洁净无油迹，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌膜宜薄。2.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。3.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。4.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。六、实验作业(一)绘图绘出Bacillussubtilis和Escherichiacoli革兰氏染色视野图。(二)问题和思考1．你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？2．当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？强调实验后处理的重要性通过正反两方面再次强调实验注意事项布置本次实验报告和思考题5新乡医学院实验课教案首页课程名称：微生物学授课教师姓名及职称：丰慧根教授一、授课题目实验二细菌的芽孢和荚膜染色二、授课对象2005级生物技术专业本科生三、实验教学目标与课时分配1、继续学习微生物标本的制作方法；2、掌握芽孢、荚膜染色的基本原理及方法;3、巩固无菌操作技术。3课时四、授课重点1、微生物标本的制作方法；2、芽孢、荚膜染色的方法及注意事项五、授课难点1、微生物标本的制作方法；2、芽孢、荚膜染色的方法及注意事项六、授课形式实验课讲授七、授课方法与课前准备授课方法：启发式教学，讨论式教学；课前准备：做预实验，准备示教材料，写教案八、教材与参考文献沈萍、范秀荣、李广武主编。《微生物学实验（第三版）》，高等教育出版社。九、思考题1．若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因?2．组成荚膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，为什么?十、教研室主任及课程负责人签字教研室主任（签字）课程负责人（签字）年月日年月日新乡医学院实验课教案6课程名称：微生物学授课教师姓名及职称：丰慧根教授基本内容教学手段和教学组织细菌的芽孢和荚膜染色法一、实验目的1、继续学习微生物标本的制作方法；2、掌握芽孢、荚膜染色的基本原理及方法;3、巩固无菌操作技术。二、实验内容和原理芽孢、荚膜染色法都是利用细菌各部位（分）的构造不同，它们对染料的亲和力也不同。因此，可以采用各种特殊染色方法，使细菌细胞的不同构造能在显微镜下显示出来，便于观察和区别。（一）芽孢染色法：芽孢又称内生孢子（endospore），是某些细菌（革兰氏染色阳性杆菌）生长到一定时间（对数期后期），在细胞内形成一个圆形、椭圆形或圆柱形的结构。芽孢有的长在中央或近中央，圆形或椭圆形，芽孢的大小，位置，在分类鉴定上有一定的意义，它仅仅是芽孢细菌生活史的一个环节，它还是检验培养基灭菌彻底不彻底的依据。芽孢壁厚、透性低，着色和脱色均较困难，当用弱碱性染料（孔雀绿）在加热的情况下进行染色时，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，当用对比度大的复染色剂（蕃红液）染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，是芽孢和菌体更易区分。菌体呈红色而芽孢呈绿色。（二）荚膜染色法荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶状物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽。由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可以溶于水，易在用水冲洗时被除去。荚膜虽不是细胞的主要结构，但它是细胞外碳源和能源性贮藏物质，并能保护细胞免受干燥的影响，同时能增加某些病原菌的致病能力，使之抵御宿主吞噬细胞的吞噬。先点评上次实验作业结合理论知识讲解实验原理7由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可以溶于水，易在用水冲洗时被除去。通常用负染色法染色，使细菌和背景着色，背景与菌体之间形成一透明区即荚膜，便于观察，由于荚膜很薄，容易变形，在制片是一般不用加热固定。三、实验器材1、菌种：蜡样芽孢杆菌约2d营养琼脂斜面培养物；褐球固氮菌(Azotobacterchroococcus)约2d无氮营养基琼脂斜面培养物。2、染色液和试剂：5％孔雀绿水溶液、0.5％蕃红溶液、碳素墨水、甲醇、生理盐水等3、器材：试管夹、酒精灯、接种针、载玻片、显微镜、香柏油、乙醚酒精、擦镜纸等。四、实验方法1、芽孢染色：（1）制片：按常规涂片、干燥、固定；（2）染色：用试管夹夹住玻片的一端，在涂片上滴加孔雀绿3－4滴，维持5min；（3）水洗：待玻片冷却、用细水流冲洗至流出的水为无色；（4）复染：蕃红溶液复染2-3min，水洗；（5）镜检：干后，先低倍镜观察，再高倍镜观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察。2、荚膜染色（湿墨水法）：（1）制备菌和墨水混合液：加一滴墨水于洁净的载玻片上，然后挑取少量褐球固氮菌与之充分混合均匀；（2）加盖玻片：将一洁净盖波片盖在混合液上，然后在盖波片上放一张滤纸，轻轻按压以吸去多余的混合液；（3）镜检：用低倍镜和高倍镜观察。五、注意事项1、供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使