HBVDNA荧光定量PCR技术

一、HBVDNA荧光定量PCR技术（一）标本血清、血浆（其它如组织细胞、乳汁、精子、尿液等体液）；标本应封闭保存，特别在夏季，如果标本暴露的过久，开盖保存，很容易出现水分蒸发，检测结果和上一次的检测结果会有较大的差异。环境条件影响不大，比如保存在-8°、-20°、24°、还是室温，对高中低病毒含量的最后的检测结果影响不是太大，只要封闭保存就可以。因此可常温运输，但不可泄露。（二）检测方法国内最常使用PEG（聚乙二醇方法）法进行核酸提取，采用TaqMan探针进行荧光PCR扩增。扩增40循环进行结果分析，如下图一所示：典型的双S形的曲线图，越早出现荧光曲线的病毒含量越高，越晚越低。根据不同的梯度的四个标准品进行定量。如果血清或标本里面没有病毒，就是一个阴性直线。最近我们在彻底解决污染问题之后采用扩增50个循环的方法。优点是让扩增管里的反应液充分反应，缺点是如果实验室存在一个潜在的污染或操作人员操作习惯不好，很容易出现携带污染，造成假阳性。对实验室的来说不应该通过减少扩增的循环数来解决污染问题，而应该通过科学的管理，提高试剂的质量，以及养成一个良好的操作习惯，或防污染的习惯来解决假阳性的问题。增加循环数有利于标本检测结果的判断，这将来可能是实验室发展的一个趋向。COBASTaqMan技术在我们国家已经有好多实验室有这种全自动的核酸提取扩增系统，它的优势重点在于检测病毒含量比较低的血清标本，但是对于病毒含量比较高的，往往出现荧光PCR竞争的缺点。图一为：PCR扩增曲线（三）污染的预防与排除PCR扩增产物污染是PCR反应中最主要最常见的污染问题，所以扩增区的仪器如枪头等要注意。最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。标本处理区，包括扩增摸板的制备；PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增；产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。切记:产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染。（四）常用仪器常用的PCR仪器：ABI系列、罗氏系列、安捷伦系列、国产SLAN等。（五）临床意义检测血清或血浆HBVDNA阳性有什么临床意义？1.判断血清中是否有HBVDNA的存在我们检测到的HBVDNA包括完整HBV病毒和DNA片段。目前我们用的HBVDNA荧光PCR法，还不能区分是完整病毒还是片段。只要检测到的病毒载量在检测线以上就可以定为标本含有HBVDNA。2.判断抗病毒疗效的评估指标细胞内HBVDNA和HBVDNA确认方法。病人采用各种抗病毒药物，比如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦或替米夫定等抗病毒药物，因为这些药可以有效的抑制病毒复制，用药之前或用药之后，病人的血清里或外周血白细胞里是不是还有病毒的存在？病毒下降了多少？是不是有病毒的反弹？这是临床医生关心的问题。随着抗病毒药物用药时间的延长，有些病人血清里面的HBVDNA一直处于检测线以下。因此目前临床医生有一些新的需求，就是能不能确认病人血清里究竟有没有HBVDNA。不同的实验室报告检测低限值不一样，有的实验室报1000IU，有的实验室报100IU，COBASTaqMan12个，12个还是有病毒，血清里究竟有多少个？是临床急需的一种HBVDNA确认方法。即确认血清里面究竟有没有病毒。现在已经提出一种检测方法。3.HBVDNA阳性与传染性感染乙肝病毒必须达到一定的量，突破各种屏障（血液里的补体、细胞因子、抗体等），进入肝细胞复制，才能达到传染性的要求，因此并不是接触到病毒都会被感染。HBeAg的产生与意义→HBeAg与HBVDNA清除的不平衡带来的异常模式→HBsAg的包裹与剪切（完整HBV形成）→不同形式HBsAg的产生与意义。抗HBc、抗HBe和抗HBs的产生。四，HBVDNA定量与乙肝血清学模式不同组合的意义。大三阳（表面抗原、E抗原和核心抗体阳性）并抗HBs阳性：HBsAg/IgM。E抗原阳性说明病人体内的乙肝病毒处于一种活跃性的复制状态。这时有的病人合并表面抗体的阳性，是不是获得一定的抵抗力？不是。表面抗体往往是病毒复制时诱发了机体免疫答应而产生相应的抗体，这个抗体是针对表面抗原的IgM大蛋白抗体。因此它是机体对乙肝病毒复制免疫反抗的结果。这时要提高病人或保持病人的免疫功能；小三阳并抗HBs阳性：病毒活动性复制、不同型病毒的感染等；抗HBs或抗HBc与HBVDNA同时阳性：细胞内HBV的释放。4.血清游离和细胞内HBV检测与抗病毒治疗的关系乙肝病人体内的病毒分成两个病毒状态，一个是游离的病毒，一个是细胞内的病毒，包括肝细胞和血细胞。游离的病毒意味着要被清除掉的病毒，除了个别的病毒再进入肝细胞，进行感染肝细胞。而细胞内的病毒与抗病毒治疗的效果更有直接的关系，如果要彻底清除乙肝病毒，最终检测肝脏细胞里病毒是阴性。但是肝穿只能局限于肝穿的组织，不能代表整个肝脏。近几年对外周血HBVDNA的研究越来越多，外周血HBVDNA先消失，然后肝细胞游离的DNA再消失。即通过检测外周血HBVDNA来间接反应肝脏细胞里DNA是不是存在。虽然不能相互代替，但比血浆里面的DNA更进了一步。重性肝炎发生胆酶分离，检测不到血清里的病毒，但是外周血里面的HBVDNA反而和胆酶分离之前的水平一致。有的临床研究数据报道，如果外周血里的HBVDNA逐渐下降或消失，病人基本上得以康复。外周血HBVDNA的检测对重性肝炎患者的预后判断有重要的意义。5.血清cccDNA与肝脏组织内cccDNA的不同意义最早的观点认为cccDNA是双价闭环环状DNA，它只在肝细胞里存在。后来越来越多的研究者发现，血清里不但有cccDNA，而且也有肝组织内的cccDNA。因为血清里的cccDNA是从坏死的肝细胞释放出来的，并且它是环状的，不易被蛋白结合，也不易被消化，因此与肝组织内的HBVDNA有着不同的意义。目前认为血清里的cccDNA存在是病毒启动复制的标志，即病毒正处在复制的上升期，而肝组织内的cccDNA是病毒慢性化的标志。如果判断抗病毒药物效果，检测血清里的cccDNA没有太多的意义，而肝组织内的cccDNA反而有意义。即如果外周血HBVDNA已经转移到检测线以下，判断病毒是不是彻底清除？我们要检测肝组织内的cccDNA。血清cccDNA阳性代表病毒复制处在上升期。（六）生物暴露与措施1.无损伤暴露部位的清洗方法不同，如果血清溅到衣服上，通过有效的消毒液进行浸泡、清洗，一般浸泡的时间不能低于半个小时；如果溅到皮肤上，直接用洗涤液来洗，不要用力搓，要轻搓，然后用流水冲掉；如果溅到眼睛上，最忌讳的是用力来揉搓眼睛，用清水冲洗，一般病毒很难通过皮肤黏膜。也要对溅到你眼睛的血浆里做一个鉴定，看看它是不是含有病毒，病毒含量高低。2.创伤暴露确定污染源HBV含量状态，如果高于104以上，感染的可能性很大，如果低于104以下，感染的可能性非常小。要在最短时间内要注射有效的高效价免疫球蛋白。3.特殊人群的讨论孕妇和儿童。如果孕妇在怀孕以前是乙肝，尽可能建议孕妇通过干扰素或核苷类似物把体内的病毒降到检测线以下，停药3个月再怀孕。有的孕妇怀孕7、8个月发现自己感染了乙肝，这时不主张终止妊娠，应该保持自身良好的免疫状态和良好的精神状态，在孩子出生以后要第一时间使孩子和母亲的血液脱离，同时对孩子注射高效价免疫球蛋白。可以对脐血进行检测，脐血里HBVDNA是阴性，孩子就没被感染。1、HCVRNA(+)和抗HCV(—)是（B）A既往感染B感染的初期C慢性化感染的过程D肝癌的早期2、COBASTaqMAN技术的优势是（C）A重复性好B灵敏度高C检测病毒含量比较低的血清标本D检测病毒含量比较高的血清标本3、关于HCVRNA核酸提取的注意事项说法错误的是(D)A核酸裂解时间不应太长，避免72℃温育处理B过柱离心时间和速度应均一C洗脱液应加到层析柱中间D配置好的试剂剧烈震荡混均4、下列哪种疾病属于慢性病毒感染（D）AHAVBHEVCSARSDHCV5、国内最常使用的HCV核酸提取方法是（D）APEGB煮沸法C磁珠吸附法D层析柱法6、PCR反应中最主要最常见的污染问题是（A）APCR扩增产物污染B标本交叉污染C大片段核酸的污染D反应液污染7、如果抗HBS抗体水平和抗HBVDNA同时很高，应考虑是(A)A不同HBsAg亚型病毒的双重感染B机体免疫清除的重要信息C血清转换的标记DHBV感染急性期8、大三阳并抗HBs阳性说明（D）A细胞内HBV的释放B病毒活动性复制C不同型病毒的感染D抗体是针对表面抗原的IgM大蛋白抗体9、血清游离和细胞内HBV检测与抗病毒治疗的关系说法错误的是（C）A游离的病毒意味着要被清除掉的病毒B细胞内的病毒与抗病毒治疗的效果更有直接关系C肝细胞游离的DNA先消失，然后外周血HBVDNA再消失D检测外周血HBVDNA来间接反应肝脏细胞里DNA是不是存在10、目前临床最常见的ELISA酶标记物是（A）AHRPBAPC葡萄糖氧化酶D半乳糖苷酶