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实验五病原性球菌目的(一)掌握致病性葡萄球菌的特征；抗链球菌溶血素“O”试验；甲型链球菌与肺炎链球菌区别。(二)熟悉三种链球菌在血平板上的区分；肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌的形态特征。(三)了解病原性球菌的形态、染色性。内容(一)病原性球菌的形态及染色性(示教)。(二)葡萄球菌培养及生化特性(示教)。(三)致病性葡萄球菌的鉴定(操作)。(四)链球菌的培养与抗链球菌溶血素“O”试验(示教与操作)。(五)肺炎链球菌与甲型链球菌的区别(示教)。(六)脓汁或咽拭子分离培养(操作)。一、病原性球菌的形态及染色性(示教)1．葡萄球菌的形态及染色性(示教)【材料】金黄色葡萄球菌革兰染色示教片。【方法】油镜观察细菌的形态、排列及染色性。2．链球菌的形态及染色性(示教)【材料】乙型链球菌血清肉汤培养物制作的革兰染色示教片。【方法】油镜观察链球菌的形态、大小、排列及染色性。3．肺炎链球菌的形态结构及染色性(示教)【材料】肺炎链球菌革兰染色示教片、肺炎链球菌荚膜示教片。【方法】油镜观察二张示教片中肺炎链球菌的形态结构特点及其染色性。4．脑膜炎奈瑟菌的形态及染色性(示教)【材料】2脑膜炎奈瑟菌革兰染色示教片。【方法】油镜观察注意形态、大小、排列以及染色性。5．淋病奈瑟菌的形态及染色性．【材料】淋病性尿道、阴道脓汁涂片（革兰染色）。【方法】油镜观察细菌形态、排列、在细胞内或外及染色性。二、葡萄球菌培养及生化特性(示教)【材料】1．金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌血琼脂平板培养物2．金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌甘露醇管【方法】1．取金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的血琼脂平板培养物，观察二种葡萄球菌单个菌落的形态、大小、表面、边缘、透明度、颜色及溶血性(如颜色不易区别时，可用滤纸片揩抹菌落观察)。2．取金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的甘露醇发酵管，观察二者对甘露醇的分解情况。三、致病性葡萄球菌的鉴定致病性葡萄球菌的鉴定，一般实验室都根据以下特征，其中尤以血浆凝固酶试验意义最大。1．产生金黄色色素。2．对家兔或羊红细胞有溶血作用。3．分解甘露醇，产酸不产气。4．血浆凝固酶试验阳性。5．耐热DNA酶试验阳性。血浆疑固酶试验：试管法(示教)【材料】见实验四。【方法】见实验四耐热DNA酶试验(示教)3【原理】致病性葡萄球菌能产生DNA酶，它可特异地分解DNA的磷酸戊糖联结的磷酸二酯键；且有明显耐热性，经180℃15分钟或60℃2小时也不灭活。此酶最适pH9.0，在含DNA基质的琼脂一Tris缓冲液中(PH9.0)，随DNA被分解指示剂甲苯胺蓝从蓝色变粉红色。【材料】经100℃煮沸15分钟后的金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌24小时液体培养物；甲苯胺蓝-DNA-琼脂(PH9.0)。【方法】1．取装有3ml甲苯胺蓝-DNA-琼脂培养基的小试管置沸水浴中溶化，浇小玻片一块(琼脂全部用完)，待琼脂冷却凝固后，以3mm直径打孔器打2个孔。2．用无菌滴管吸取加热冷却后的金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌菌液，加人不同的小孔中，置37℃培养2~3小时后观察结果。3．凡小孔周围出现透明粉红色小圈者为阳性，小孔周围仍为蓝色不透明者为阴性。注：指示剂甲苯胺蓝在酸性中呈红色，在中性或弱碱性溶液中呈蓝色。四、链球菌的培养与抗链球菌溶血素“O”试验(一)培养特性(示教)【材料】甲、乙、丙三型链球菌血琼脂平板及乙型链球菌10％兔血清肉汤培养物。【方法】1．观察三种链球菌在血琼脂平板上的菌落形态，注意其大小、表面、透明度及溶血情况。2．观察链球菌在10％兔血清肉汤中生长情况(混浊、沉淀、表面生长)。(二)抗链球菌溶血素“O”(ASO)试验(操作)【原理】链球菌侵人体内可释放溶血素“O”(SO)，它刺激机体产生相应抗体(ASO)。试验时先以溶血素“O”与病人血清混匀产生中和反应，再加入SO乳胶试剂，若病人血清中ASO量很多，未被中和掉的抗体则与乳胶试剂反应，产生清晰凝集，是为阳性；反之为阴性，故本试验属体外中和反应，观察到的现象为间接凝集。【材料】8单位/毫升链球菌溶血素“O”，l:15病人血清，链球菌溶血素“O”乳胶试剂，黑底玻片，滴管，对照（正常）血清。【方法】1．取已稀释的病人血清与正常血清各一滴，分别滴于玻片的两侧，然后于两侧4各加一滴8单位/毫升链球菌溶血素“O”，晃摇或用牙签混匀2分钟，使其充分混匀。2．于上述混合液中各加一滴乳胶试剂，晃摇或用牙签混匀3分钟，使其充分混匀。3．立即观察结果：(1)有清晰凝集者为阳性，血清滴度500单位/毫升。(2)无凝集者为阴性。“注”：若需进一步测定其血清滴度，用生理盐水将阳性血清再作对倍稀释，再按第2项进行实验，若仍呈清晰凝集时，则血清滴度800单位/毫升。五、肺炎链球菌与甲型链球菌的区别(示教)(一)培养特性(示教)【材料】肺炎链球菌及甲型链球菌血琼脂平板培养物【方法】观察并比较两种细菌菌落的大小、形态及溶血性等。(二)菊糖发酵试验(示教)【材料】肺炎链球菌及甲型链球菌菌落，菊糖发酵管。【方法】1．挑取肺炎链球菌及甲型链球菌菌落分别接种于菊糖发酵管中，37℃培养10~24小时。2．观察两种细菌在葡糖管中生长后的情况，以溴甲酚紫变色与否作为是否发酵菊糖的判断依据。(三)胆汁溶菌试验(示教)【材料】肺炎链球菌及甲型链球菌血清肉汤培养液18小时生长物，去氧胆酸钠溶液，干燥小试管，1毫升无菌吸管、试管架、生理盐水、37℃水浴。【方法】1．取洁净小试管4支，标明1、2、3、4。于第一及第二管内各加入0.2毫升牛胆汁或10%胆盐溶液，第三及第四管中各置0.2毫升生理盐水。2．用一吸管取0.8亳升肺炎链球菌血清肉汤培养液置于第一管，再吸取0.8毫升至第三管。用另一吸管吸取0.8毫升甲型链球菌血清肉汤培养物于第二管；又0.8毫升于第四管，混匀后置37℃水浴箱中15分钟到一小时，取出观察，若液体变清即为胆汁溶菌阳性，否则为阴性。5六、脓汁或喉拭子分离培养(操作)【材料】1．标本：脓汁或喉拭子。2．培养基：血琼脂平扳、甘露醇发酵管、菊糖发酵管。3．兔血浆、生理盐水、毛细滴管、吸管、小试管、试管架、革兰染液、玻片。【方法】1．将脓汁或喉拭子作涂片(注意先分离培养，后作涂片，避免污染)，革兰染色后镜检，观察细菌形态、排列及染色性。2．将脓汁或喉拭子材料接种血琼脂平板，置37℃培养18~24小时。3．根据菌落特点及涂片检查结果，作出初步判断，必要时再作进一步鉴定。（1）若菌落中等大小、完全溶血、不透明、产生金黄色色素、涂片革兰染色阳性，葡萄状排列，可能是金黄色葡萄球菌，可进一步做血浆凝固酶试验和甘露醇发酵试验，确定其致病力。（2）若菌落较小、半透明、完全溶血、涂片革兰染色阳性、大都呈链状排列，为乙型链球菌。（3）若菌落较小、半透明、绿色不完全溶血环，涂片革兰染色阳性、呈短链状排列，为甲型链球菌或肺炎链球菌，需要进一步鉴别，可作胆汁溶菌和菊糖发酵试验。学生通过判别做进一步的实验（甘露醇发酵和菊糖发酵试验）。将接种后的甘露醇发酵管和菊糖发酵管放入37℃孵箱。附录：血琼脂平板培养基：加热融化pH7.6的肉汤琼脂培养基100毫升，冷至45℃~50℃时，以无菌操作加入脱纤维的兔血或羊血5~10毫升。摇匀后倾注平板，冷凝后即成。37℃孵誉24小时，无菌生长，即可使用。血琼脂平板是营养培养基，因血液内含多种营养物质，可促进营养要求较高的细菌的生长。血琼脂平板也可用来检测细菌的溶血性。血液不耐热，故需待琼脂稍冷后才能加入。脓汁或喉拭子涂片、革兰染色、镜检血琼脂平板观察菌落特征及溶血情况生化反应、致病力试验及药敏实验接种