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《生物学实验Ⅰ——微生物》（2008级基地班）任课教师：熊芳教学时数：15学时实验周数：4周生物学实验教学中心微生物实验目录（15学时）微生物实验基础知识介绍实验一：培养基的配制与灭菌（4学时）实验二：土壤自生固氮菌的分离纯化（5学时）实验三：显微镜的使用和简单染色（3学时）实验四：革兰氏染色和荚膜染色（3学时）第一次实验：微生物学实验基础知识一、实验目的1.熟悉实验室规则和安全守则，正确应对实验中出现的意外事故；2.认识微生物学实验室常用仪器和有关试剂的基本知识；3.掌握实验报告的正确书写。二、实验内容1.实验室规则；2.实验室安全守则；3.实验室中意外事故处理；4.常用器皿及用具；5.显微镜及有关知识；6.实验预习、实验记录和实验报告。实验一培养基的配制和高压蒸汽灭菌配置培养基的基本流程如下：原料称量→溶解→调节pH值→过滤澄清→分装→塞硅胶塞和包扎→灭菌培养基的配制原则一、营养成分1.根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基，如自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。异养微生物的培养基至少需要含有一种有机物质。碳源物质的功能：构成细胞物质；为机体提供整个生理活动所需要的能量（异养微生物）。氮源(nitrogensource)凡是提供微生物营养所需的氮元素的营养源，称为氮源。氮源物质的主要作用是合成细胞物质中含氮物质，少数自养细菌能利用铵盐、硝酸盐作为机体生长的氮源与能源，某些厌氧细菌在厌氧与糖类物质缺乏的条件下，也可以利用氨基酸作为能源物质。能源指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。2.注意各种营养物质的浓度与配比营养物的浓度：在一般情况下，浓度合适的营养物质才对微生物表现出良好作用，浓度大时对微生物生长起抑制作用，浓度小时不能满足微生物生长的需要。各营养物质之间的浓度比：培养基中各营养物质之间的浓度比直接影响微生物的生长与繁殖和（或）代谢产物的形成与积累，尤其是碳氮比（C／N）（碳氮比一般指培养基中元素碳与元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白两种成分含量之比）的影响更为明显。二、控制培养基的PH值各类微生物生长的最适pH各不相同，细菌与放线菌生长的pH在7-7.5之间，酵母菌与霉菌生长的pH值在4-5之间。在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，常会改变培养基的pH值，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式：内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。外源调节：按实际需要流加酸或碱液三、渗透压注意营养物质要有适合的浓度，不能太低满足不了生长的需要，太高则渗透压太大，也会抑制微生物的生长四、氧化还原电位氧化还原电位越高，培养基的氧化活动越强，在厌氧菌培养中，加入还原剂，可降低自由氧的毒害。培养基的种类据组成成分可分为:1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。如葡萄糖铵盐培养基、淀粉硝酸盐培养基等。2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。例如，马铃薯蔗糖培养基。3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。从培养基的物理状态可分为1.液体培养基：不加凝固剂（常用凝固剂为琼脂）的液体状态培养基。2.固体培养基：在液体培养基中加入1-2%左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.2—0.5%凝固剂而成的半固体状培养基。按照培养基的用途，可将其分为1.加富培养基：加富培养基是指在普通培养基里加过血、血清、动物（或植物）组织液或其他营养物质（或生长因子）的一类营养丰富的培养基，用以培养某种或某类营养要求苛刻的异养微生物。2.选择培养基：选择培养基是根据某种或某一类群微生物的特殊营养需要或对某种化合物的敏感性不同而设计出来的一类培养基。利用这种培养基可以将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。3.鉴别培养基：普通培养基中加入能与某种代谢产物发生反应的指示剂或化学药品，从而产生某种明显的特征性变化，以区别不同的微生物。牛肉膏蛋白胨培养基的制备一、实验原理牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl.其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量的琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下96℃时溶化，实际应用时，一般在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH值调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏3.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g水1000mlpH7.4～7.6。二、实验器材1、溶液和试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/LnaOH，1mol/LHCl。2、仪器或其他用具试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳/皮筋，纱布等。三、操作步骤1、称量：按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏，蛋白胨，NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。2、溶化：在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需要的总体积，如果配置固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.5%～2.0%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同时进行，节省时间。在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需不断地搅拌，以防琼脂培糊底烧焦。配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中。3、调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH,边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/LHCl进行调节。对于有些要求pH较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。pH不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。配置pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解而不能凝固。4、过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去。5、分装按实验要求，可将配置的培养基分装入试管内或三角烧瓶中。（1）液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。（2）固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的量以不超过三角瓶容积的一半为宜。（3）半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。6、加塞a)包扎：加塞后，将全部试管用麻绳/皮筋捆好，再外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿塞，其外再用一道麻绳/皮筋扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配置日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配置日期。（有条件的实验室，可用市售的铝箔代替牛皮纸，省去用绳扎，而且效果好。）b)灭菌：将上述培养基以0.103Mpa,121℃，20min高压蒸气灭菌。c)搁置斜面：将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右（以防斜面上冷凝水太多），将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。d)无菌检查：将灭菌培养基放入37℃的温室中培养24～28h，以检查灭菌是否彻底。阿斯毕无氮培养基甘露醇（或蔗糖、葡萄糖）10gKH2PO40.2gMgSO4.7H2O0.2gNaCl0.2gCaSO4.2H2O0.1gCaCO35g琼脂20g水1000mlPH7.0~7.2121℃灭菌30分钟高压蒸汽灭菌一、目的要求1．了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。2．学习高压蒸汽灭菌的操作方法。二、基本原理高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2．26kJ（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。实验室中常用的高压蒸汽灭菌锅有立式、卧式和手提式等几种，其构造如图。本实验介绍手提式和立式高压蒸汽灭菌锅的使用方法。三、器材牛肉膏蛋白胨培养基，阿斯毕无氮培养基，培养皿，立式高压蒸汽菌锅等。四、操作步骤1．首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。2．放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。3．加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。4．用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用1．05kg/cm2，121．3℃，20分钟灭菌。5．灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。6．将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。五、实验报告1．结果检查培养基灭菌是否彻底。2．思考题（1）高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么要待压力降到0时才能打开排气阀，开盖取物？（2）在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素？第二次实验：实验二土壤自生固氮菌的分离和纯化一、实验目的：1、学习微生物的纯系分离、培养方法；2、掌握稀释分离、划线分离、涂抹分离纯化微生物的方法。二、基本原理：为了生产和科学的需要，往往需要从自然界混杂的微生物群中分离单一的菌种，这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物分离。为了获得某种微生物的纯培养，可采用下列两种方法：一种是提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。如要从土壤中分离自生固氮菌，则培养基中是不能含有N源，这种培养基就比