HRM在水产领域中的应用

高分辨率熔解曲线（HRM）在水产领域中的应用Xxx上海海洋大学水产与生命学院摘要饱和荧光染料、未标记探针与实时荧光PCR结合产生的高分辨率熔解曲线(HRM)是一种新的实时定量技术,在检测速度、灵敏度和准确性上具有突出的优点，在水产领域中，国际上已有人将其应用于基因突变扫描、基因分型和品种鉴定。关键词高分辨率熔解曲线，水产，基因突变扫描，基因分型，品种鉴定1.引言高分辨率熔解曲线分析技术（HighResolutionMelting，HRM），是由美国犹他大学保健科学中心病理学部CarlWittwer实验室与美国Idaho公司于2003年共同合作开发出来的最初应用于SNP(singlenucleotidepolymorphism,单核苷酸多态性)检测分析的一项新技术，并于2006成功生产出世界上第一台商品化的HRM仪器HR-1[1,2]。HRM技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性、特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。2.HRM的原理及操作流程2.1HRM的原理HRM技术主要是根据核酸分子熔解温度和熔解形状的不同来区分样品。在PCR反应时引入饱和的荧光染料LCGreenplus，荧光染料在PCR扩增的过程中被嵌入到DNA双链中。当嵌有染料的DNA分子解链的时候，仪器对荧光信号进行采集，绘制出DNA分子的熔解曲线。DNA分子的熔解曲线与DNA分子的GC含量，GC分布，片段长度等理化性质有关，不同的样品由于碱基作用力的不同呈现出不同的熔解曲线形状及熔解温度(Tm值)[3]。以二倍体细胞为例，当纯合子样品通过PCR扩增，经过变性复性后，仍然是纯合子，如图1（Tube1和Tube2）。而杂合子PCR扩增完，经过变性复性后，样品中会形成部分的含有非沃森-克里克配对的双链分子存在，如图1（Tube3）。图1LightScanner突变检测原理杂合子样品相对纯合子样品来说，双链不够稳定，表现在解链温度上就会有微小的差别。如果采用高分辨率的仪器进行检测，并用专门的软件进行分析，微小的差别就会被检测出来，从而成功的筛选出纯合子与杂合子，如图2。图2杂合子样品的熔解曲线为四种不同双链的熔解曲线的叠加的结果在双链体的溶解曲线检测时需要添加合适的染料，常规Real-timePCR利用SYBRGreen染料标记DNA双链,但是SYBRGreen是一种大分子即不饱和染料,在DNA双链解链的过程中，SYBRGreen分子会发生重排，从已解链DNA片段上脱离下来的染料分子又与尚未解链的双链DNA结合，造成结果失真，并且嵌合到产物中的染料如果在扩增过程中不能及时脱落，还会抑制PCR反应[4]。HRM采用新型的饱和染料如LCGreen,不仅没有饱和染料的缺点,而且更易于检测单碱基突变、小片段插入或缺失[5,6],如图3。Tube1Tube2Tube3WildtypeHomozygoteHeterozygote图3非饱和染料SybrGreen在DNA双链熔解时会发生位置的迁移，饱和染料LCGreen在DNA双链熔解时则直接从双链上脱落下来2.2HRM的操作流程HRM的操作流程如下：（1）添加荧光染料进行PCR反应，扩增目标区域；（2）对PCR产物进行热变性，采集数据；（3）通过专业数据分析软件分析，获取样品的SNP信息[7]。目前，研究突变以及SNP的研究方法主要有DHPLC、SSCP、DGCE、MS、测序等，所有这些方法都需要样品通过凝胶或者其他基质来分离，其中一些方法还需要额外的酶处理或者化学处理，在这些步骤中PCR产物直接暴露在环境当中，都会增加在后续处理中受污染的风险。在用HRM方法进行分析时,样本经PCR扩增后直接进行HRM,PCR产物无需再转入其他分析装置,而直接在同一个PCR管内进行分析,实现了真正的闭管操作，如图4。图4进行突变扫描的几种常用方法的流程图比较3.HRM在水产领域中的应用3.1基因突变扫描与基因分型高分辨率熔解曲线分析在封闭的体系中进行,不仅降低了污染风险、节省了时间,而且PCR后不需要对PCR产物进行处理与分离，可以不受碱基突变位点和种类的局限，既可以对已知突变进行分析，又可以对未知突变进行筛查、扫描。另外，HRM分析是目前仅次于SNP芯片的中高通量SNP分型技术[8]。YuHaiyang等[9]首先用测序法研究东方牡蛎丝氨酸蛋白酶抑制基因的多态性及其抗病性关联，在cvSl-1基因的273aabp编码区发现了12个SNPs，同时用高分辨率熔解曲线分析了东方牡蛎一个家系的cvSl-1基因的SNP198，表现为明显分离的三种基因型，发现抗病系的C等位基因的频率明显比敏感系的高。SmithBL.等[10]用小片段+内标探针和未标记探针，对箭鱼（Xiphiasgladius）种群的乳酸脱氢酶（ldh-A），肌球蛋白轻链-2（mlc-2），酸性核糖体磷蛋白P0（ARP）和钙调蛋白（CaM）中的核基因进行基因分型。结果表明，HRM是一个研究野生种群基因分型的强大工具。3.2品种鉴定HRM可以应用于微生物品种、物种快速鉴定以及动植物品种鉴定。McGlauflinMT.等[11]利用高分辨率熔解曲线（HRM）发现了11个新的鉴别虹鳟和切喉鳟的SNPs。发现HRM能准确地识别DNA序列的核苷酸变化。4.HRM的缺陷A.对PCR反应、熔解仪器、荧光染料要求较高由于双链DNA的熔解动力学受到很多因素的影响,比如DNA模板质量、镁离子含量、缓冲液组成等,所以HRM要求DNA样品由同一种方法提取,经纯化使DNA样品浓度一致。对引物及扩增片段要求高,常需反复实验,验证是否适用于HRM。熔解仪器要求非常高的温度精密度和温度均一性。荧光染料不影响PCR反应且能饱和结合双链DNA。B.突变扫描不能精确区分扩增片段中的不同杂合突变有时不同的杂合突变导致相似的熔解曲线,需进一步经混样法区分,或小片段法、非标记探针法、Snapback探针法进行基因分型提高分辨率。C.HRM对于大片断插入或缺失不敏感此时需采用定量PCR先评估基因含量。D.PCR扩增产物的长度受到限制随着扩增片段的增加,其敏感性及特异性降低。5.展望高分辨率熔解曲线在基因分型、突变扫描与序列匹配研究中非常简便,近几年来在医学领域中发展迅速。饱和荧光染料的普及、未标记探针与实时定量PCR的结合,使得该技术无论在速度、灵敏度、准确性,还是在经济上都很符合检测要求。高分辨率熔解曲线技术不仅将在医学领域被广泛应用,还会广泛应用于动物基因检测、植物病理、微生物分型和食品安全检测等方面。相信将来也会广泛地应用到水产领域中。参考文献[1]GundryCN,VandersteenJG,ReedGH,etal.Ampliconmeltinganalysiswithlabeledprimers:aclosed–tubemethodfordifferentiatinghomozygotesandheterozygotes[J].ClinChem,2003,49(3):396-406.[2]WittwerCT,ReedGH,GundryCN,etal.High–resolutiongenotypingbyampliconmeltinganalysisusingLCGreen[J].ClinChem,2003,49(6):853-860.[3]TaylorFC.Mutationscanningusinghigh-resolutionmelting.BiochemSocTrans,2009,37,433-437.[4]LipskyRH,MazzantiCM,RudolphJG,etal.DNAmeltinganalysisfordetectionofsinglenucleotidepolymorphisms[J].ClinChem,2001,47:635-644.[5]GrahamR,LiewM,MeadowsC,LyonE,WittwerCT·ClinChem,2005,51:1295~1298·[6]WittwerCT,ReedGH,GundryCN,etal.ClinChem,2003,49:853~860.[7]MontgomeryJ,WittwerCT,ZhouL,etal.Simultaneousmutationscanningandgenotypingbyhigh-resolutionDNAmeltinganalysis[J].NatureProtocols,2007,2(1):59-66.[8]赵琼一,李信,罗达,等.后基因组时代下作物的SNP分型方法.分子植物育种[J],2010,8(1):125-133.[9]YuH.,HeY.,WangX.,ZhangQ.,BaoZ.,GuoX.Polymorphisminaserineproteaseinhibitorgeneanditsassociationwithdiseaseresistanceintheeasternoyster(crassostreavirginicagmelin).Fish&ShellfishImmunology,2011,30(3):757-762.[10]SmithBL.,LuC.,BremerA.High-resolutionmeltinganalysis(HRMA):Ahighlysensitiveinexpensivegenotypingalternativeforpopulationstudies.MolecularEcologyResources,2010,10(1):193-196.[11]McGlauflinMT.,SmithMJ.,WangJT.,YoungSF.,ChenN.,LeeYC.High-resolutionmeltinganalysisforthediscoveryofnovelsingle-nucleotidepolymorphismsinrainbowandcutthroattroutforspeciesidentification.TransactionsoftheAmericanFisheriesSociety,2010,139(3):676-684.