HIV核酸检测技术及应用

HIV核酸检测技术及应用目录HIV核酸简介HIV核酸检测意义HIV核酸检测技术现状与发展HIV核酸检测质量控制HIV核酸检测流程（新规范）HIV核酸检测实例应用HIV病毒病毒颗粒：呈球形，直径100-120nm病毒衣壳：呈20面体立体对称病毒核心：由RNA（两条ssRNA）、核衣壳蛋白、逆转录酶、核糖核酸酶及整合酶所组成HIVRNAHIV生活周期图HIV前病毒DNAHIV感染的自然史急性感染期无症状期艾滋病期HIV感染后标志物变化时间HIVRNAp24AgIgMAnti-HIVIgGAnti-HIVReactivity012345678Weekspost-infectionHIV核酸检测的意义HIV核酸缩短窗口期指导治疗自然史艾滋病的“元凶”病程耐药性HIV核酸检测的意义HIV-1感染诊断婴儿感染早期诊断（小于18月龄）HIV-1感染补充试验及急性期和晚期感染者的诊断治疗效果监测通常在治疗一个月后病毒载量降低0.5log以上才被认为临床治疗有效，六个月后应降到小于检测限病程监控及预测耐药性监测HIV核酸检测技术分为HIV定性和HIV定量检测两大类：HIV定性检测：HIV核酸（RNA和前病毒DNA）的检测HIV定量检测：又称HIV病毒载量检测（Viralload），主要用于抗病毒治疗患者的疗效评价，也可用于补充试验（新规范）HIV核酸定性检测IN-HOUSE（文献报道）RocheAmplicorHIV-1DNAPCR,v1.5试剂盒(已停产)RocheCOBAS®AmpliPrep/COBAS®TaqMan®HIV-1QualitativeTest,v2.0雅培RealTimeHIV-1定性检测试剂盒HIV病毒储存库的检测技术（超敏PCR）In-house普通PCR诊断方法核酸提取PCR或RT-PCR扩增电泳鉴定或测序HIV-1的基因组结构结构蛋白酶类衣壳蛋白~9.2kb检测设计：分别针对HIVgag、env和pol的三个独立PCR检测体系，并另外设立1个检测内参（β-actin）的检测体系（国家艾滋病参比实验室）阳性：扩增出人β-actin，HIV-1gag、env和pol基因中扩增出2个及以上基因片段阴性：扩增出人β球蛋白基因，HIV-1gag、env和pol3个基因都没有扩增出来不确定：人β球蛋白基因未扩增出预期的片段或HIV-1gag、env和pol3个基因只扩增出一个In-house普通PCR诊断方法“套式”PCRAAAAAA5’3’gagpolenvReverseprimer1Forwardprimer1第一轮PCR产物Reverseprimer2Forwardprimer2第二轮PCR产物优点:增加敏感性/特异性缺点:增加扩增偏差机会需要增加操作过程容易增加污染机会琼脂糖凝胶电泳β-actingagenvpolIn-house荧光PCR国内外文献报道以HIVRNA或前病毒DNA作为检测目标，选择LTR、gag、pol等基因作为靶基因，建立荧光PCR检测方法0102030405060050000100000150000200000ADeltanRnCycleNumberFAMCY501020304050600100000200000300000400000BDeltanRnCycleNumberFAMCY5HIV核酸阴性HIV核酸阳性罗氏HIV-1QualTest基于COBAS®AmpliPrep®/COBAS®TaqMan48平台，用于HIV-1RNA和前病毒DNA的定性诊断，检测样本类型包括抗凝全血、血浆、血清、干血斑或干浆斑等TheCOBAS®AmpliPrep/COBAS®TaqMan®HIV-1QualitativeTest,v2.0Dual-PCRtargetAssaydesigngag:•TargetedinpreviousRocheHIV-1tests•LargesequencedatabasefromRoche’sGlobalsurveillanceprogram•NotadrugtargettodayLTR:•TargetedinRocheMPxbloodscreeningtest•Notadrugtargettoday检测总核酸（DNA/RNA）检测结果示例阴性阳性HIV核酸定量检测HIV病毒载量(ViralLoad)指体内复制的病毒的数量，反映体液（一般是血浆）中HIV病毒的含量1987年John首次提出病毒载量（viralload）的概念，体内复制的病毒的数量是不能直接测量的，一般用血浆中HIVRNA的拷贝数代表HIV的病毒载量。是HIV核酸的定量检测，一般以血浆HIVRNA的拷贝数/ml表示常用的HIV病毒载量检测方法主要核酸扩增和信号放大扩增两种方法NASBA/EasyQ(Biomerieux,生物梅里埃)CobasAmplicor/Taqman(Roche，罗氏)m2000(Abbott，雅培)bDNA/Versant440(西门子)国内：凯杰（匹基），科华，达安、东北制药、万泰丽珠、科华等NucliSENSEasyQ血浆样本miniMAGeasyMAG病毒载量分析仪引物2NASBA扩增技术（nucleicacidsequence-basedamplification,核酸序列依赖性扩增法）逆转录酶逆转录酶T7RNA聚合酶逆相RNA扩增物RNaseH引物1引物1延伸RNaseH和引物2延伸RNAT7RNA聚合酶逆转录酶逆转录酶“分子信标”杂交AMV-RT(鸟肉瘤病毒逆转录酶):延伸形成RNA-DNA杂交链RNaseH:降解杂交链中的RNAT7-RNA聚合:转录形成的RNA转录产物T7启动子序列COBAS®AmpliPrep®/COBAS®TaqMan48COBAS®AmpliPrep®/COBAS®TaqMan48®系统完整探针:报告基团(R)的荧光被淬灭基团(Q)抑制h引物引物RQ探针被5’-外切核酸酶切掉QR报告基团的荧光发射hQRR=报告基团Q=淬灭基团TaqMan水解探针技术雅培HIV-1病毒载量仪m2000全自动实时荧光定量PCR系统•HIV-1病毒载量自动化检测平台（96通量）•已认证用于干血斑病毒载量检测•婴儿HIV-1核酸检测试剂盒•用于实验室in-house方法的自动化核酸提取•此平台同时有HBV病毒载量，HCV病毒载量及分型，HPV高危分型，MTB检测，CT/NG检测等试剂盒bDNA(BayerversantTM)核酸信号的放大！而非核酸分子的扩增！•人工加样•试剂分装•自动化提取•人工配液•PCR仪检测•临床式半自动使用方案北京万泰生物药业股份有限公司PCR仪结果导入WanTag全自动核酸提取仪PCR检测HIV核酸定量检测试剂-全自动化平台强强联合整合Tecan加样与Thermo核酸提取平台高通量同时可用，实现1h内96份样本的提取高自动化可自动完成包括加样、核酸提取与纯化、PCR试剂配制与分配等扩增前的所有操作采磁棒转移技术，有效避免气溶胶污染中文自主操作界面，方便快捷达安基因HIV病毒载量核酸检测系统•HIV-1核酸定量检测试剂盒•全自动核酸提取仪•DA3200•国产化！全自动！PANTHER系统——TMA（转录介导的等温扩增）简易的工作流程：“上样”直接到“结果”，3.5小时得到第一个样本结果，每分钟一个结果，12个小时500个样本核酸检测在新版规范主要内容新增补充试验的概念，补充试验包括抗体确证试验和核酸试验（定性和定量试验）新增核酸检测流程，对复检结果有反应的情况，增加了可以选择核酸诊断的策略；对于HIV抗体确证结果不确定和疑似急性期感染的样品建议采用HIV-1核酸试验。修改了艾滋病感染产妇所生儿童HIV感染早期感染检测流程补充试验（核酸试验）初筛+复检+HIV定性检测试剂盒试剂：必须是经国家食品药品监督管理总局注册批准、在有效期内的试剂。严格按说明书操作。全球目前正式用于临床诊断HIV-1急性期感染的核酸检测试剂比较少Gen-Probe公司生产的AptimaHIV-1RNA核酸定性试剂盒Abbott公司生产的M2000HIV-1RNA/DNA定性检测试剂盒Roche公司生产的COBAS®AmpliPrep/COBAS®TaqMan®HIV-1QualitativeTest,v2.0HIV核酸定性检测——适应范围（1）诊断婴儿早期感染（2）诊断急性HIV-1感染。针对对HIV-1抗体筛查阴性、近期有流行病学史的个体,或确证结果不确定的样本,核酸定性检测可用于诊断HIV-1急性期感染。（3）确定艾滋病病毒感染。针对HIV-1抗体筛查阳性或确证结果不确定的个体，结合流行病学史和临床病史，核酸定性检测可用于HIV-1感染诊断。艾滋病晚期患者可能出现HIV抗体反应不确定，可根据HIV核酸定性检测结果，结合临床病史和CD4+T淋巴细胞计数等情况，进行综合判断，确定临床诊断。结果判读与报告检测结果显示“有反应”或“检测到”，报告“HIV-1核酸阳性”；检测结果显示“无反应”或“未检测到”，报告“HIV-1核酸阴性”。核酸定性检测值低于最低检测限的结果，不能排除HIV-1感染，需根据流行病学史、临床病史和实验室相关指标进行综合判断。目前国内外没有商品化的HIV-2核酸检测试剂HIV定量检测的试剂盒试剂：必须是经国家食品药品监督管理总局注册批准、在有效期内的试剂。严格按说明书操作。NASBA/EasyQ(Biomerieux,生物梅里埃)CobasAmplicor/Taqman(Roche，罗氏)m2000(Abbott，雅培)bDNA/Versant440(西门子)国内：凯杰（匹基），科华，达安、东北制药、万泰丽珠、科华等HIV核酸定量检测——适用范围（1）监测抗病毒药物治疗效果。抗病毒药物治疗前后，定期病毒载量分析和监测，结合CD4+T淋巴细胞计数，有助于抗病毒药物治疗方案的确定和修改。（2）监测疾病进展。定期检测HIV-1病毒载量，有助于监测感染者和病人的病程变化，结合CD4+T淋巴细胞计数，为抗病毒药物治疗提供病毒学依据。（3）诊断急性HIV-1感染。针对HIV-1抗体筛查阴性、近期有流行病学史的个体，或确证结果不确定，核酸定量检测可用于诊断HIV-1急性期感染。（4）确定HIV-1感染。针对HIV-1抗体筛查阳性或确证结果不确定的个体，结合流行病、和临床病史和CD4+T淋巴细胞计数等，使用核酸定量检测帮助确定HIV-1感染。结果判读与报告用于治疗效果和病程监测：检测值小于试剂盒线性范围下限，报告低于检测限，检测值大于等于试剂盒线性范围下限，按照检测值报告。用于HIV-1感染的诊断：检测值5000CPs/ml(或IUs/ml)，报告检测值；检测值≤5000CPs/ml(或IUs/ml)，尽快再次严格按核酸检测的要求采样检测，报告检测值，结果5000CPs/ml(或IUs/ml)，报告检测值，结果仍≤5000CPs/ml，则需充分结合流行病学史、临床病史、CD4+T淋巴细胞计数和HIV-1抗体随访检测结果等进行综合判断检测值低于最低检测限不能排除HIV-1感染。（注：目前国内外没有商品化的HIV-2核酸检测试剂；由于核酸定量检测方法获得的低病毒检测值可能是核酸污染所致的结果，根据国内外的相关数据和报道，建议用5000CPs/ml作为判断结果的阈值，两次定量检测有助于准确判断结果）。集合核酸定性检测（PoolingPCR）对高危人群抗体检测阴性的样品进行集合核酸检测，可及时发现窗口期HIV-1感染者；用于血液筛查可进一步降低“残余危险度”该方法较单份样品的核酸检测具有更高的成本效益。集合PCRHIV核酸即时检测(POCT)HIV核酸即时检测是在发病或者发生事件的地点进行检测，能快速获得检测结果并及时反馈一线医务人员的一类检测方法。POCT检测适用范围广泛，且可避免样本长途运输导致的质量下降，非专业人员经培训后也可操作。可用于H