HPLC法测定维生素B族片中3种组分的含量

HPLC法测定维生素B族片中3种组分的含量摘要：目的获取维生素B片中B1、B2、B6的含量，测量方法是运用高效液相色谱法对三种成分同时进行测量。方法运用C18柱，流动相以1.0ml/min流动，流质为0.005mol/L的庚烷磺酸钠溶液（0.05%三乙胺0.5%冰醋酸）-甲醇。紫外检测波长为280nm。结果本实验中维生素B1,B2,B6线性范围分别为2.964～74.1mg·ml-1，2.934～73.35mg·ml-1，2.996～74.9mg·ml-1,三种成分的方法回收率依次是97.5%，99.7%，100.5%，RSD依次是1.21%，1.5%，0.9%。结论该方法分离质量佳，高效快捷，能够很好的控制多维片中维生素B1、B2、B6的质量。关键词：HPLC法，维生素B族片；维生素B1，维生素B2，维生素B6B族维生素由于其水溶性特点在人体新陈代谢中扮演着重要的角色。维生素B族片在临床上主要用于防治因缺乏多种B族维生素所致的各种疾病,同时也常作为营养及能量补充剂。对B族维生素分析检测目前有些报导采用分光光度法[1]电化学法[2]、荧光法，微生物法等，操作繁琐费时。本文用HPLC法在对含有多种维生素的片剂中维生素B1、维生素B2、维生素B6的含量测定时同时进行测定，得到满意结果，该方法简便、准确、快速、重现性好，可用于对维生素B1，维生素B2，维生素B6的质量控制。1.实验仪器与试药1.1仪器Agilent1200高效液相色谱仪1.2试剂产自国药集团的冰醋酸和三乙胺均为分析纯；而自东京化成工业株式会社进口的庚烷磺酸钠是色谱纯；甲醇（TEDIACOMPANY,LOT001917）为色谱纯。试验过程中的水一律采用蒸馏水；三种成分的对照品全是中国药品生物制品检定所提供，其中维生素B1对照品的批号是100390-200301；B2对照品的含量98.7%、批号是100369-200502，维生素B6对照品的批号是100116-200502）。1.3试药B族维生素片（批号：20100203，规格：700mg/片，厦门某公司）；多维他咀嚼片三批（批号：分别为20090102、20090103、20090104，福建某公司）2.实验前处理2.1混合对照溶液的制备采用精密方法秤取对照品，本文所有的秤取方法仍然采用精密方法进行，不在特别强调。三种成分均为15mg。尤其注意维生素B2粗腰在105℃条件下持续干燥2小时后方可秤取。然后将三种对照品放在加有适量水的100ml量瓶中，并在65℃水浴振摇15min后冷却至室温，摇匀并定容后作为混合对照品储备液。2.2供试品溶液的制备取样品20片并研细，秤取适量，置于加有适量水的50ml量瓶中，置65℃水浴振摇15min后冷却至室温，定容并摇匀，作为供试品溶液。2.3样品与对照品预处理将“3.1，3.2”制备的样品与对照品溶液用0.45um微孔滤膜过滤，将续滤液置于液相小瓶，上机测定。3.实验方法与结果3.1色谱条件色谱柱为SunFireTMC18柱,AgilentTC-C18柱；流动相是0.005mol/L的庚烷磺酸钠溶液（0.05%三乙胺0.5%冰醋酸）-甲醇（65：35，v/v）；流速为定只能，大小为1.0ml·min-1；检测波长为280nm；进样量是20ul。在上述条件基础上对上文的混合对照品储备液和样品溶液作进样分析，结果，三种维生素B的理论塔板数不低于2000，分离度大于等于2，色谱详见图1。min02.557.51012.51517.5mAU020406080100VWD1A,波长=280nm(LJ\LJ2010-03-2210-13-54\DZ1.D)321AB图1A混合对照液B样品溶液1.维生素B62.维生素B23.维生素B13.2线性关系考察各自精密量取1ml,5ml,10ml,15ml,20ml，25ml“3.1”项中的混合对照储备液，放在50ml量瓶中，稀释并摇匀。然后再以上文的色谱条件为基础，分别进样20ul注入高效液相色谱仪并绘制关于图谱的标准曲线，横坐标为浓度C(mg·ml-1),纵坐标为峰面积A，详情参考表1与图2-1、2-2、2-3。表1线性得到维生素B1、维生素B2、维生素B6回归方程分别为y=16.894x-10.844，维生素B1峰面积维生素B2峰面积维生素B6峰面积C(mg/ml)AC(mg/ml)AC(mg/ml)A2.96441.62942.934166.082692.99641.629414.82239.939514.67829.7198514.98239.939529.64488.0562729.341530.7086229.96488.0562744.46738.3707344.012064.6157244.94738.3707359.28986.7513458.682728.4948759.92986.7513474.11245.7965173.353406.1760374.91245.79651mi02.57.112.117.mA02468101214VWD1A,??=280nm(LJ\LJ2010-03-2210-13-54\GSP2.D)123y=44.903x+118.84，y=3.0968x-5.0853表明维生素B1、维生素B2、维生素B6分别在2.964～74.1mg·ml-1，2.934～73.35mg·ml-1，2.996～74.9mg·ml-1这个区域内具有较好的线性关系。3.3精密度试验精密吸取“3.1”项下混合对照品溶液，每次进样20μl，共重复6次。以维生素B1、维生素B2、维生素B6峰面积计算，RSD为0.20%，0.01%，0.01%。见表2。表2123456平均值RSD（%）VitB1711.5712.5711.9714.0712.9715.4713.00.20%VitB22354.42359.22356.02355.62359.52355.82356.80.01%VitB61433.11433.61434.71434.21432.91433.51433.70.01%3.4重复性试验精密称定样品（B族维生素片）约2.0g作进样测定，方法参考“4.8样品测定”项的方法，其中进样量为20μl，n=6，结果样品中维生素B1、B2和B6平均含量分别为98.32%，99.17%，99.55%，RSD分别为2.22%，0.88%，0.68%.见表3。表3重复性试验的测定结果样品称样量（g）维生素B1、维生素B2、维生素B6含量（%）11.9981100.997.799.222.002899.399.699.532.001196.099.4100.142.007599.898.899.152.000198.599.298.861.997795.4100.3100.63.5稳定性试验分别在0，2，4，6，12，24h进样供试品溶液，依次测定，维生素B1、B2和B6RSD（n=6）分别为2.0%，1.2%，0.9%。结果说明正常储藏条件下，24小时内样品溶液成分稳定。3.6加样回收率试验分别精密称取2.18g批号为20090102、20090103、20090104的多维他咀嚼片，放在50ml的量瓶中，再将“3.1”项下混合对照品储备液分别加入5ml量，摇匀并定容至刻度。通过求解获得回收率依次为97.5%，99.7%，100.5%，RSD值依次是1.21%，1.5%，0.9%，3.7耐用性试验比较了2种色谱柱（流动相比例相同），理论板数在2000以上，分离度和保留时间在规定要求内，说明该方法耐用性较好。（见表3）表3耐用性试验色谱柱VB2VB6分离度VB1保留时间柱效AgilentTC-C18柱；5um,4.6×250mm5umSunFireTMC18柱，4.6×150mm5um(流速均为1.0ml·min-1)3.095.0914.618.1100951006312613122109091117253.8样品测定各称取多维他咀嚼片和B族维生素片10片并研细，然后精密称取约3片的量放在50ml量瓶中，并按照“3.2“项制备供试品溶液。另取适量的维生素B6、B2（105℃干燥2小时）和B1，制做三种成分各为0.045mg/ml的混合对照品溶液；然后精密量取20μl注入液相色谱仪，并计算峰面积，即得。表5单位:ug组分123平均RSD%B族维生素片维生素B1维生素B2维生素B6758.1901.6751.5744.9895.1763.3761.3887.8755.2754.8894.8756.71.150.770.80多维他咀嚼片维生素B1维生素B2维生素B6255.9314.7215.2252.2304.8218.3250.8300.6216.8253.0306.7216.81.042.360.724.讨论4.1流动相的选择在参考文献[6]的基础上，选择了庚烷磺酸钠作为离子对试剂来分离三种B族维生素，曾选用磷酸盐缓冲液代替庚烷磺酸钠，而且考察了甲醇分别为28%，30%，35%，40%不同比例下的流动相中峰形和样品分离效果的影响，结果说明了庚烷磺酸钠-甲醇（65：35，v:v）时结果满意。另外，文献[7]中提示三乙胺的加入对于维生素B6和维生素B2的分离度小及维生素B1峰形严重拖尾的状况均有显著改善，保留时间也大幅度缩小。经过多次实验，获得最佳流动相条件为0.005mol/L的庚烷磺酸钠溶液（0.05%三乙胺0.5%冰醋酸）-甲醇（65：35，v/v）。4.2检测波长的选择照“2.2.1”项下配制三种单个维生素对照品溶液，用UV对200～350nm的吸收光谱分别进行扫描，由图谱3-1、3-2和3-3知，237nm和262nm区间颞维生素B1最大吸收，237nm和262nm区间内维生素B2最大吸收，290nm和323nm维生素B6最大吸收。综上所述，本实验监测波长为280nm。4.4结语本实验方法简单、快速、分离效果好、一次性分析多种B族维生素，而且能够对制剂中维生素B1、B2和B6的含量进行测定，为B族维生素质量标准的质量从试验的角度提供了一定的依据和参考。参考文献【1】刘红河，黎源倩．分光光度法测定粮食中的维生索B．[J]．中国卫生检验杂志，2002．12(3)：268—269。【2】邓光辉，李济权，马少妹，高效毛细管电泳电导法快速检测复方维生素B片中的VB1、VB(12)、VB6和VC.[J].分析试验室，2003.04（5）：123-126、