微生物学检验实验指导

微生物学检验实验指导2009．7一、《微生物学检验》实验目的要求1．通过实验验证理论知识，并掌握比较全面的微生物学基本操作技术。2．在微生物学实验过程中建立无菌观念，掌握无菌操作技术。3．通过实验进一步掌握临床常见病原微生物的生物学性状、分离培养和鉴定的方法、各种临床标本的微生物学检验程序和方法。4．在实验过程中逐渐培养独立思考问题、分析问题和解决问题的能力。二、微生物学实验室规则及实验室意外处理方法1．微生物学实验室规则由于微生物学实验是以病原微生物为研究对象，在实验过程中任何疏忽大意都有可能引起实验人员的自身感染或实验室和周围环境的污染。因此，实验中应严格遵守实验规则，建立无菌观念，严格无菌操作，防止实验过程中出现意外情况，并确保实验结果的准确。（1）试验前须预习实验内容，了解实验目的、方法和注意事项，做到心中有数，避免发生错误，提高实验效率。（2）进入实验室必须穿工作服，必要时还须戴口罩、帽子和手套，并做好实验前的各项准备工作。（3）非必需物品禁止带入实验室，带入实验室的物品应远离操作区，放在指定的区域。（4）实验室内不准大声喧哗、嬉戏，应保持实验室的安静、整洁和有序。不准在实验室内吸烟、饮水和进食，尽量避免用手触摸头、面部，防止感染，尽量减少室内活动，以免引起风动。（5）实验中注意节约试剂，爱护仪器，避免有菌材料的污染，如有传染性材料污染桌面、地面、手、衣服或发生其他意外情况，应立即报告老师及时作适当处理。（6）用过的污染物品应放到指定的地点，经专人消毒灭菌之后再进行清洗，切勿乱丢或冲入水池中。禁止将本实验室的物品带出实验室外。需送温箱培养的物品，应标记清楚后送到指定地点。（7）实验完毕后应将桌面整理清洁，试剂、仪器放回原处，并用浸有消毒液的抹布将操作台擦拭干净，打扫卫生，关好水、电、门窗。（8）离室前脱下工作服，反折放在指定的地方；双手在2％来苏液中浸泡5min左右，再用肥皂、清水洗净，方可离开实验室。2．实验室意外的紧急处理方法（1）发生皮肤破损或刺伤：首先用肥皂和水冲洗伤口，尽量挤出损伤处的血液，并用70%乙醇或其他皮肤消毒剂进行消毒，立即进行医疗处理。（2）化学药品腐蚀伤：若为强酸，用大量清水冲洗后再以5%碳酸氢钠溶液中和；若为强碱，用大量清水冲洗后再以5%醋酸或5%硼酸溶液中和；若受伤处是眼部，经上述方法处理后，再滴入橄榄油或液体石蜡1~2滴。（3）烧伤：局部涂凡士林、5%鞣酸或2%苦味酸。（4）菌液误入口中：立即将菌液吐入消毒容器中，再用1∶1000高锰酸钾或3%过氧化氢漱口，根据菌种服用适当抗生素预防感染。（5）菌液污染环境：将适量2~3%来苏或0.1%新洁尔灭浸泡污染面半小时后除去，如手上有菌污染，也可浸泡于上述消毒液中3~5min，之后用肥皂和清水洗净。三、生物安全防护知识简介医学检验工作人员长期接触有潜在传染性的血液、粪便、体液等标本，这些标本往往是各种细菌、病毒等病原微生物的传播载体，无论是实验人员感染，还是造成实验室和周围环境的污染，都将导致严重的后果。因此实验室工作人员在实验过程中必须高度重视实验室生物安全防护，强化生物安全意识，熟悉生物安全防护有关知识，严格无菌操作。1．微生物的分类等级根据世界卫生组织（WHO）出版的《实验室生物安全手册》，将微生物分为四个不同危险度等级：危险度1级是指不能引起人或动物致病的微生物，此类微生物无或仅具有极低的个体和群体危险；危险度2级的病原体具有中度个体危险，低度群体危险，能引起人或动物致病，但对实验室工作人员、社区、家畜或环境不易导致严重危害，所引起的感染具有有效的预防和治疗措施，并且疾病传播的危险有限；危险度3级的病原体具有高度个体危险，低度群体危险，通常能引起人或动物的严重疾病，但一般不会发生感染的播散，并且对感染具有有效的预防和治疗措施；危险度4级的病原体具有高度的个体危险和群体危险，通常能引起人或生物的严重疾病，并且很容易发生个体之间的直接或间接传播，对感染一般没有有效的预防和治疗措施。基于以上划分标准，结合微生物的致病性、传播方式、目前所具有的预防和治疗措施等因素，我国卫生部于2006年制定了《人间传染的病原微生物名录》，对各种病原微生物的危害程度及其相关实验活动需要达到的生物安全实验室级别做了详细分类，各实验室进行有关实验均需参照此标准。2．生物安全实验室分级与要求由于各种病原微生物的危险度等级不同，因此实验室必须达到相应的生物防护等级才能开展有关实验。根据WHO《实验室生物安全手册》和我国卫生部2002年颁布的《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》，实验室从生物安全防护的角度共分为四级：一级生物安全防护实验室（BSL-1）为实验室结构设施、安全操作规程、安全设备适用于危险度1级的微生物，依据标准操作程序可进行开放性操作，如用于教学的普通微生物实验室即属此类。二级生物安全防护实验室（BSL-2）适用于对人或环境具有中等潜在危害的微生物，即危险度2级的病原体，该级别实验室应具备生物安全柜和密封的离心管，以免发生泄漏和产生气溶胶。三级生物安全防护实验室（BSL-3）适用于有明显危害、可以通过空气传播的病原微生物（如结核杆菌、伯氏立克次体等），通常已有预防传染的疫苗，该级别实验室除了有严格的一级和二级安全设施要求外，还需具备合适的空气净化系统。四级生物安全防护实验室（BSL-4）适用于对人体具有高度的危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明，目前尚无有效的疫苗或治疗方法的致病微生物及其毒素。BSL-4实验室必须与其他实验室隔离，并具备特殊的空气和废物处理系统，实验操作须在Ⅲ级生物安全柜内或全身穿戴特制的正压防护服。根据以上定义，医院内的临床实验室因接触可能含有致病微生物的标本，通常应达到二级生物安全防护实验室要求。根据《实验室生物安全认可准则》，二级生物安全实验室结构设施需符合以下几点：（1）实验室需具有防止节肢动物和啮齿动物进入的设计，有可开启的窗户，有纱窗，实验室门有可视窗带锁并能自动关闭。（2）每个实验室均应设置洗手池，宜设置在靠近出口处。（3）实验室工作区域外有足够的存储空间及摆放个人衣物的设施。（4）实验室内墙壁、地面应平整、防滑、易于清洁，不适宜用地毯。（5）实验台面应能防水、耐腐蚀、耐热。（6）实验室内应保证工作照明，避免反光和强光。（7）在实验室内应穿戴隔离衣、帽、手套，必要时戴防护眼镜。实验室应备有生物安全柜。（8）有适当的消毒设施，如高压蒸汽灭菌器，并设置洗眼装置、应急喷淋装置、急救药箱、灭火器等。（9）有可靠的电力供应和应急照明。（10）在实验室出口处设有在黑暗中可明确辨认方向、通道的标识。（11）在实验室入口处和装有传染性物质的设备表面贴有生物危险标志。3．实验室生物安全管理制度实验室生物安全制度建设对于临床实验室而言是生物安全防护的核心，实验室生物安全管理制度应包括：实验室准入制度、生物安全培训制度、生物安全责任制和责任追究制度、生物防护与安全制度、安全检查制度、个人防护制度、实验室管理制度、清洁消毒制度、安全计划审核制度、废弃物处理制度、事故报告制度、生物安全防护应急预案、标准操作程序等。建立健全了各项生物安全制度，还应成立生物安全管理领导小组，加强生物安全制度实施情况的监督管理，实验室入口处须粘贴生物安全标志，注明危险因素，生物安全级别，负责人姓名和电话，进入实验室的特殊要求及离开程序，禁止非工作人员进入实验室，如需参观实验室等特殊行为需经实验室负责人的批准后方可进入。4．实验室常见生物危险实验室生物污染的途径包括：空气传播（临床标本中的污染源在空气中传播、微生物气溶胶的吸入）、直接传播（工作中偶然刺伤、割伤，碎玻璃划伤直接感染）、皮肤粘膜接触（临床标本中的传染源通过破损皮肤粘膜接触造成的感染）、其他不明原因的实验室相关感染。实验室伤害以及与工作有关的感染主要是由于人为失误﹑不良实验技术以及仪器使用不当造成的。因此，实验室人员必须提高生物安全意识，认真学习生物安全相关的各种法规和文件，定期进行生物安全防护知识培训，熟悉生物防护有关知识，加强基本技能的培养，严格执行操作规程。实验室管理者应对实验室的风险级别进行分析，尤其对风险级别较高的、接触高危标本几率较大的区域如微生物和分子生物学室予以高度重视，保护实验室工作人员和环境的安全。5．生物废弃材料的管理实验室内所有用过的样本、培养物及其他生物性材料等废弃物，严禁未经处理就随意丢弃，应置于贴有生物危害标志的专用废弃物处理容器内，注意容器的充满量不能超过其设计容量，利器（如针头、小刀、玻璃等）应置于耐扎锐器盒内，在去污染或最终处置前应存放在指定的安全地方，经过高压灭菌或其他无害化处理后再安全运出实验室；有害气体、气溶胶、污水、废液等均需经无害化处理后排放；动物尸体、组织的处置和焚化应符合国家相关要求。处理危险废弃物的人员需经过专业培训，并使用适当的防护设备。第一章微生物学检验基本技术实验一细菌的形态结构观察及显微镜油镜的使用【目的和要求】1．熟悉微生物实验室规则并自觉遵守。2．掌握细菌基本形态和特殊结构的观察方法。3．掌握光学显微镜油镜的使用和维护方法，了解荧光显微镜和暗视野显微镜的构造和使用方法。【试剂与器材】1．示教片：各种球菌、杆菌、弧菌、荚膜、鞭毛、芽胞的示教片。2．器材及其他：光学显微镜、载玻片、擦镜纸、香柏油、脱油剂等。【实验内容】一、细菌基本形态和特殊构造的观察1．细菌的基本形态（各种球菌、杆菌、弧菌等）观察要点：注意细菌的染色性、相对大小、形状及排列方式。2．特殊结构的观察（荚膜、芽胞、鞭毛）观察要点：注意这些特殊结构的大小、形状及其在菌体中的位置，均有助于细菌的鉴定。二、光学显微镜油镜的使用1．光学显微镜的构造光学显微镜是观察细菌形态最常用的一种仪器，其构造分为机械部分和光学部分，机械部分包括：镜座、镜臂、载物台、镜筒、镜头转换器、调焦装置等；光学部分包括：接物镜、接目镜、反光镜、聚光器、光圈等（见图1-1）。图1-1光学显微镜的构造显微镜的接物镜有低倍镜、高倍镜、油镜三种，放大倍数依次增高，其识别方法为：（1）低倍镜：镜头标志为10×或10/0.25，镜头最短，其上常刻有黄色环圈。（2）高倍镜：镜头标志为40×或40/0.65，镜头较长，其上常刻有蓝色环圈。（3）油镜：镜头标志为100×或100/1.30，镜头最长，其上常刻有白色环圈，或“oil”字样。2．油镜的使用原理图1-2显微镜油镜的使用原理油镜的放大倍数高而透镜很小，自标本片透过的光线，因玻片和空气的折光率不同（玻璃n=1.52，空气n=1.0），部分光线经载玻片进入空气后发生折射，不能进入接物镜，致使射入光线较少，物象不清晰。在油镜和载玻片之间滴加和玻璃折光率相近的香柏油（n=1.515），则使进入油镜的光线增多，视野光亮度增强，物象清晰（见图1-2）。3．使用方法（1）采光：使用显微镜时必须端坐，将显微镜放在胸前适当位置。将低倍镜转到中央并对准下面的聚光器，打开光圈，转动反光镜，使光线集中于聚光器（以灯光为光源时，使用凹面反光镜，以自然光为光源时用平面反光镜）。根据所观察的标本，通过升降聚光器和缩放光圈以获得最佳光度。当用低倍镜或高倍镜观察时，应适当缩小光圈，下降聚光器；当用油镜观察时，光线宜强，应把光圈完全打开，并将聚光器上升到最高位置。（2）低倍镜调焦：将欲观察的标本置载物台上，用弹簧夹和推进器固定，将待检部位移至视野正中央，上升载物台至不能升高为止。用左眼观察接目镜，缓慢调节粗调节器，使载物台下降，待看到模糊的图像时，再调节细调节器，直至看到清晰的图像为止。（3）油镜的使用：低倍镜找到物象并调至清晰之后，转开物镜头，在玻片的标本上滴加1滴香柏油，将油镜头转换至中央，缓慢调节粗调节器，使镜头浸入油中，当油镜头几乎接触玻片时停止转动（从侧面观察），边观察接目镜边轻轻转动粗调节器（此时只能上升镜头，不能下降，防止压坏玻片及损坏物镜），待看到模糊物象时改调细调节器，直至找到清晰物象。镜检时应将标本按一定方向呈“弓”形移动，直至整个标本观察完毕，以防漏检。观察时应将两只眼睛同时