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環境微生物學許美芳副教授大仁科技大學環境資源管理系mfshue@mail.tajen.edu.tw教師個人介紹•1981~1986逢甲大學環境科學系講師•1986~迄今大仁科大環境資源管理系副教授•專長:微生物、環境監測技術、ISO17025實驗室認證•研究領域:環境監測技術—生物、化學、儀器分析：水、土壤污染監測，食品及農產安全性、保健產品功能性評估、離體外生物檢測技術(InVitroBioassay)。•專業服務:實驗室認證輔導、社區營造、環境教育、環保署代檢測機構現場評鑑專家、消基會檢測組委員、地方環保局委員、環境教育輔導委員、德國杜夫萊茵TUV公司Life-careline大中華區技術總監微生物(Microorganisms)定義：存在於自然界中，構造簡單、個體微小，能獨立生存，通常無法以肉眼觀察到需藉助顯微鏡觀察之一群生物。而研究這些微小生物的相關科學稱之為『微生物學(Microbiology)』種類：細菌、真菌、藻類、病毒、原生動物及多細胞寄生蟲生物界的分類1866年Haeckel發表了三界說：三界說動物界植物界原生生物界(顯微鏡下的微小生物)1963年Whiatter提出五界說：五界說真核生物界原核生物界動物界植物界真菌界原生生物界藍綠藻細菌酵母菌(yeast)：無絲狀體黴菌(mold)：有絲狀體植物性：藻類(矽藻、紅藻)動物性：原生動物(草履蟲)巴斯德奠定了生源論後，與顯微鏡的問世，人們方知除了動植物外尚有肉眼所無法觀察的微小生物。1930's電子顯微鏡被發明問世，提升顯微鏡的放大倍率，於是發現原生生物界內的各類生物細胞內部構造不同,配合生物化學科技的發展下，也了解相同的細胞構造間成份也可能不同。微生物演進史最早發現：1665年，英國人虎克(Hooke)，製作單眼顯微鏡觀察軟木栓薄片之細胞。1676年，荷蘭人雷文霍克(Leeuwenhoek)，製成雙眼顯微鏡觀察池水，揭開了包括細菌、藻類、真菌及原生動物之神秘面紗。『細菌學之父』。生命發生說的爭論：自然發生說---亞里斯多德(希臘)生源論---巴斯德(法)---『微生物學之父』黃金時期：19世紀後半1850年~1880年，巴斯德發現水果發酵及酒的酸敗是由微生物引起。巴氏消毒法：62℃,30秒；71.5℃,15秒1878年李斯特(Lister)以連續稀釋法得到純培養菌株。1876年德國柯霍(Koch)醫生，從患有炭疽菌病之患者身上分離出炭疽桿菌(Bacillusanthrax)。由此微生物與疾病關係，奠定了病原論。並提出『柯霍假說』。1892年，伊凡諾司基(Iwanosky)，最先發現病毒的人。發現菸草鑲嵌病毒，並證明其可通過細瓷濾器。濾過性病毒。1929年，佛來明(AlexanderFleming)，發現青黴菌的代謝物能抑制葡萄球菌的增殖，此代謝物為青黴素(penicillin)。1944年，魏斯曼(Waksman)，發現鏈黴素(streptomycin)。命名•1735年，瑞典生物學家林奈氏(CarolusLinnaeus)的二名法。學名：屬名+種名，表示法：斜體或畫底線。•例：EscherichiacoliEscherichiacoli學名命名原則(常見學名表示法)屬名+種名屬名+SpeciesBacillussp.產生黃色素,意指枯草桿菌屬內之某一個種會產生黃色素Bacillusspp.有產胞能力,意指枯草桿菌屬內的所有種都具有產胞能力屬名+種名+發現者+et.alEscherichiacoilCastellaniet.al屬名+種名+（原發現者）+現發現者Bacillussubtilus(Ehrenberg)Cohn屬名+新種名+（原發現者）+現發現者屬名+種名+var.+變種名Bacillussubtilusvar.niger,意指Bacillusniger由Bacillussubtilus變異而來命名的依據形態Lactobacillus(乳酸桿菌屬)；Sarcina(八聯球菌屬)；Micrococcus(微球菌屬)；Streptococcus(鏈球菌屬)；Clostridium(梭狀桿菌屬)來源或生存處Escherichiacoli指存在大腸中生理狀態Aerobacteraerogenes-生氣體；Acetobacteraceti-生醋酸；Clostridiumbutyrium-生丁酸。形成顏色Staphylococcusaureus生”金黃色”病原性Salmonellatyphosa表”傷寒熱”習性Streptococcus(鏈球菌)mesenteroids(腸系膜）發現人名Escherichia(艾歇利希氏菌屬)；Neisseria(奈氏菌)；Erwinia(歐文氏桿菌)研究範疇範疇內容微生物形態學研究微生物體外部形狀及內部構造之科學。微生物生理學研究微生物體各胞器機能和生理之科學。微生物分類學依微生物的特性分門別類研究的科學微生物遺傳學研究微生物體遺傳、變異的科學微生物演化論研究微生物在地球上之發生及演變之科學微生物生態學研究微生物在環境中生活史及其所扮演之角色應用微生物學研究微生物在不同領域之應用科學微生物與生活名稱弊利細菌污染食物、引發疾病(沙門氏菌、金黃色葡萄球菌)食品工業(醋酸菌-醋；黃麴菌-醬油)污染物生物處理法—低成本、高效率、無二次公害自然界物質循環病毒致病(日本腦炎、疱疹病毒)基因轉殖及遺傳工程干擾素製作真菌生化武器、致病、食物腐敗(毒菇、麵包上的黑黴菌)食用菌、製造抗生素；食品釀造(青黴菌-青黴素；酵母菌-釀酒)藻類污染環境(甲藻-紅潮，污染水質)供養分及氧氣供其他生物使用(綠藻、昆布之食用顯微鏡的種類放大原理使用特性光學顯微鏡明視野顯微鏡暗視野顯微鏡紫外光顯微鏡螢光顯微鏡位相差顯微鏡電子顯微鏡穿透式顯微鏡(TEM)掃描式顯微鏡(SEM)掃描穿透式顯微鏡(STEM)電子微探分析顯微鏡(EPMA)種類原理明視野顯微鏡以自然光或電源光線為光源，使檢體本身呈現暗的狀態，視野則呈現明亮態。暗視野顯微鏡加裝特殊聚光器，誘導透光途徑，使光線自標本偏離，造成鏡檢物呈現明亮態，背景呈現暗影。紫外光顯微鏡以紫外線為光源，因其波長(180~400nm)較可見光短，所以可提高解像力。紫外光會傷害眼睛，不能直接目視需投影至螢幕。螢光顯微鏡以水銀燈為光源，其所放出波長較短的紫外光線通過被觀察的物體以激發檢體放出綠色螢光物質。位相差顯微鏡在一般光學顯微鏡上加特殊之位相差物鏡及聚光器，利用菌體各部位密度的差異，對光線折射的不同，藉以分辨活細胞內不同的構造。電子顯微鏡以電子束為光源，當檢體暴露於電子束內時可呈現三度空間(立體)的影像，或用以觀察檢體之內部構造。種類應用對象明視野顯微鏡未染色之細菌、黴菌、酵母菌、藻類及原生動物。暗視野顯微鏡觀察活菌體在活的狀態懸浮液中特殊形態之觀察。螢光顯微鏡檢視螢光反應，可應用於螢光抗體技術，因具有相當高之專一性,有助於臨床診斷技術。位相差顯微鏡檢視較大活菌體之細胞結構，如酵母菌、藻類、原生動物及一些細菌。電子顯微鏡檢視很小的菌體，如病毒及菌體之超微小構造。無法檢視活細胞。各類顯微鏡用途標本製作法：塗抹法：觀察形狀，大小，構造。懸滴法：可檢視活細胞。可觀察出：菌體細胞正常排列方式；細胞分裂時細胞的變化及其速率；運動性的鑑別：＊自主運動：鞭毛；路線呈直線規則，速度快速。＊布朗運動：為粒子與周圍流體的分子產生不平衡的碰撞而做不停的攪動。路線呈不規則，速度緩慢。鏡檢方式：乾式：放大600倍以下時使用。油浸式：需行高倍率放大時使用。避免光被空氣折射掉,在物鏡與玻片間滴油。染色技術由於微生物之細胞很小，因此一般光學顯微鏡並不容易觀察，所以常需藉助染劑(Dye)與細胞間的物理或化學作用，使細胞上色、增加對比以便於觀察。原理：細胞表面或細胞內活化位置與染劑發生離子交換。作用方式：低濃度作用長時間較高濃度作用短時間較好。染色目的：鑑別不同菌體的型態、結構，及提高放大效果並作為分類之依據染劑的種類~依帶電荷分種類組成染劑例子鹼性染劑帶顏色之陽離子與不帶顏色之陰離子組成甲烯藍細胞核及細胞粒等酸性部位染色酸性染劑由無色之陽離子與帶顏色之陰離子組成伊紅或剛果紅的鈉鹽細胞質等鹼性物質之染色中性染劑由酸性與鹼性染劑形成的複合鹽類，所以不含可解離的基團。甲烯藍與伊紅形成之複合體可自由進出死細胞之細胞膜，與死細胞結合常用鑑別染色技術染色法使用染劑用途結果革蘭氏染色法(Gramsstain)結晶紫、碘液、95%酒精、番紅分G(+)與G(-)G(+)~紫色G(-)~紅色芽胞染色(sporestain)孔雀綠、番紅分芽胞及菌體芽胞~綠色菌體~紅色鞭毛染色(flagellastain)明礬、鹼性洋紅觀察鞭毛鞭毛~紅色菌體~藍色抗酸性染色(acidfaststain)石碳酸洋紅、酸酒精、甲烯藍觀察分枝桿菌屬與非抗酸細菌抗酸菌~紅色非抗酸菌~藍色莢膜染色法(capsulestain)印地安墨觀察莢膜莢膜~淡藍色透明菌體~藍紫色微生物的培養菌體化學組成份水分主要作為代謝時的溶媒。細胞增殖期含量較高，孢子含量較少。醣類多存在黏質層、莢膜(多醣體)、細胞壁(胜肽聚醣)及細胞質中；作為能量貯存物質(如酵母菌的肝醣)及構造物質(纖維素-藻類細胞壁)用。蛋白質為細胞之基本構成分(核蛋白、脂蛋白、醣蛋白)，及生化反應中酵素的組成份。脂質主要構成細胞膜、核膜、粒腺體膜之成分(磷脂質)。核酸為DNA及RNA之構成份，DNA(遺傳物質)含量一定，存在細胞核內；RNA則於蛋白質合成旺盛之生長對數期時最高。維生素以維生素B群最多，作為輔酵素之構成份，重要者有B1、泛酸、菸鹼酸等。灰份含量較多者Na,K,Ca,Mg,P,S,Cl,Fe，在細胞中以有機或無機態存在影響微生物生長的因子外在因子(環境因子)氣體溫度pHAw或滲透壓微生物間的相互作用內在因子(營養要求)能源碳源氮源無機鹽類維生素影響微生物生長的因子外在因子(環境因子)~~溫度種類生長溫度(最適溫度)實例嗜低溫菌0~20℃(15℃)冷藏食品腐敗菌嗜中溫菌20~40℃(37℃)人體和動植物病原菌、腐敗菌嗜高溫菌40~100℃或以上(55℃)溫泉及堆肥影響微生物生長的因子外在因子(環境因子)~~pH種類生長範圍實例嗜酸性1.5~5.5醋酸菌、乳酸菌、酵母菌、黴菌(pH4~6)嗜中性6.5~7.5一般細菌(pH6.8~7.2)腐敗菌(pH6.5~7.5)；病原菌(pH6~8)嗜鹼性8.5~11.5霍亂弧菌(pH8.5~9.5)、硝化菌、根瘤菌、尿素分解菌、放線菌細胞代謝養料會產生酸或鹼，造成pH的變化。pH的改變會影響細胞內酵素活性，因而影響細胞的生長。通常會添加緩衝溶液，可使培養基不因酸或鹼的形成而改變pH值。影響微生物生長的因子外在因子(環境因子)~~Aw或滲透壓微生物種類Aw實例一般細菌0.9金黃色葡萄球菌一般酵母菌0.88麵包酵母菌一般黴菌0.80醬油黑麴菌好鹽性細菌0.75腸炎弧菌生長在含3%NaCl之培養基中耐旱性黴菌0.70Xeromycesbisoporus存在半乾性食品耐滲透壓酵母菌0.63Zygosaccharomyces蜜餞、果醬等之腐敗菌培養基含微生物生長所需之養分的培養液培養基種類~依組成分天然培養基：牛奶、馬鈴薯等含有多樣天然營養素者。化學合成培養基：依微生物營養之需求，以一定含量之特定化學成分所配製而成者。複合培養基：於化學合成培養基中，再添加一些有機抽出物的成分(如：酵母萃取液、牛肉萃取液、血清)而組成者。種類配方天然培養基脫脂乳粉100g；蒸餾水1000mL化學合成培養基檸檬酸培養液：磷酸氫銨鈉1.5g；檸檬酸鈉3g；磷酸氫二鉀1g；硫酸鎂0.2g；蒸餾水1000mL複合培養基營養肉湯(NB)：蛋白腖10g；牛肉抽取物3g；氯化鈉5g；蒸餾水1000mL培養基種類~依形態分液體培養基：培養基中無添加洋菜或明膠等硬化劑，以利於微生物的大量繁殖及化學藥劑加入的直接反應。半固體培養基：培養基中含0.5%或更少的