微生物实验(第3次实验课)

第三次实验实验内容1.热力对细菌繁殖体和芽胞的杀菌作用：（1套/组）2.紫外线的杀菌作用：（1个/组）3.抗生素敏感试验：（1套/组）4.细菌耐药性变异（示教）5.细菌的鞭毛变异（示教）6.高压灭菌器的使用（讲解）7.细菌分离鉴定程序（讲解）8.全自动微生物生化分析仪简要操作规程（讲解、参观）物理消毒灭菌法掌握的概念：消毒：指杀死物体上病原微生物的方法。但是不一定能杀死细菌的芽胞和某些非病原菌。灭菌：指杀死物体上所有微生物的方法。包括病原菌和非病原菌，细菌的芽胞和繁殖体。物理消毒灭菌法分类：热力、紫外线、电力辐射、超声波等。热力灭菌法：干热灭菌法与湿热灭菌法。使菌体蛋白氧化变性、碳化或使电解质浓缩，导致细胞死亡。使菌体蛋白变性或凝固，或导致细胞膜功能受损而致细胞质内容物漏出。一、热力对细菌芽胞和繁殖体的杀菌作用材料肉汤培养基：6支（2人/组）菌种：大肠杆菌斜面培养物、枯草杆菌斜面培养物方法接种大肠杆菌接种枯草杆菌第一步：接种细菌方法第二步：分组处理大肠杆菌枯草杆菌大肠杆菌大肠杆菌枯草杆菌枯草杆菌第一组第二组第三组对照（直接放37℃培养）100℃煮沸10min121℃高压灭菌20min冷水冲凉三组均放于37℃孵箱中培养18～24小时，观察结果并分析产生结果的原因。方法第三步：培养高压灭菌器的使用原理：蒸汽被限制在密闭的容器中，随着压力的升高，蒸汽的温度也相应升高。在103.4kpa蒸汽压下，温度达到121.3℃，维持15-20min，可杀死包括细菌芽胞在内的所有微生物。锅盖内锅外锅结果菌膜(表面生长)均匀浑浊生长沉淀生长对照:两管均有细菌生长;100℃煮沸10min:枯草杆菌有生长,形成菌膜;大肠杆菌无生长。高压灭菌:两管均无细菌生长.结果普通条件培养下细菌生长状况枯草杆菌大肠杆菌100℃灭菌后细菌生长状况枯草杆菌大肠杆菌三、紫外线的杀菌作用紫外线的特点：穿透力较弱，可被普通的玻璃、纸张、尘埃、水蒸气等阻挡，只用于手术室、传染病房、实验室或不耐热物品的表面消毒。波长在200～300nm的紫外线具有杀菌作用，以265～266nm的紫外线杀菌作用最强。主要是使同一股DNA上相邻的嘧啶通过共价键结合成二聚体，影响DNA正常碱基配对，干扰DNA的复制与转录，引起细菌的突变或死亡；还能使空气中的氧转化为臭氧而具有杀菌作用。原理普通琼脂平板（1个/2人）菌种：金黄色葡萄球菌液体培养基接种环紫外灯材料方法1、取2～3环菌液于平板中央；2、接种环涂均匀；3、放紫外线灯箱，用平板盖盖住1/2平皿，照射30min；4、取出后放37℃培养24h观察结果。紫外线照射一侧无细菌生长。结果照射一侧未照射一侧四、抗生素敏感实验纸片法原理一定大小的浸沾了一定的稀释度的抗生素的滤纸片，贴附于已涂满被测细菌的琼脂平板上，孵育后因药物的抑菌作用及渗透性，纸片周围可出现透明的抑菌圈。根据抑菌圈的有无和大小，从而测知被测细菌对抗生素是否敏感。菌种：大肠杆菌和葡萄球菌肉汤培养物普通琼脂平板（1个/人）接种环、镊子抗生素纸片：青霉素、链霉素、复方新诺明、环丙沙星材料方法青链复环1、用接种环将菌液均匀的涂抹于平板表面（方法同紫外线）；2、在平板底部用蜡笔分成4区；3、镊子烧灼灭菌、冷却，夹取纸片放于各区；4、作好标记放37℃培养24h测量抑菌圈的大小，判断结果。注意：1、镊子冷却后才能夹取纸片；2、纸片间距离不能太密。含药物的滤纸片含菌平板抑菌圈37℃培养结果复链青环复环青链葡萄球菌大肠杆菌绿脓杆菌五、耐药性变异细菌产生抗药性的机制：改变药物作用机制；产生各种钝化酶；R质粒编码乙酰转移酶、磷酸转移酶、腺苷转移酶；改变细胞膜通透性。方法不耐青霉素耐青霉素六、细菌的鞭毛变异含0.1%石炭酸琼脂培养基无此现象.普通琼脂培养基迁徙生长七、全自动微生物生化分析仪VITEK2系统简易操作规程介绍主机聪明仪（一）基本功能1、从分离菌落中对微生物进行鉴定；2、对分离菌株进行抗生素敏感试验；3、以MIC比较分析为基础利用高级专家系统来进行菌株耐药表型分析。（二）卡片1、鉴定卡GNB/GN革兰阴性杆菌鉴定卡；GPC/GP革兰阳性球菌鉴定卡；YST酵母菌鉴定卡；BBL需氧芽孢杆菌。2、VITEK2卡片细菌鉴定原理是一组放在64个30l容积小孔的标准化及微量化试验。这些小孔放有一些乾燥的反应培养基，被测试的菌液是接种到这些培养基上。每个小孔代表一个生化反应，有些小孔是用作读数对照。细菌的新陈代谢令孔内底物在培养过程产生反应，从而使荧光物产生变化，每15分钟仪器会以波长365nm的激发光照射每个生化接收二极管收集激发后产生的445nm波长的光讯号。这里有两种荧光指标要检测:微生物的新陈代谢导致pH值改变、酶的活性。3、药敏卡AST-GNxx革兰阴性杆菌药敏卡AST-Pxxx革兰阳性球菌药敏卡4、药敏试验的主要原理仪器会连续分析64-孔试卡（微孔内）内的细菌生长。每孔都放有一种抗生素，并且能产生微需氧及其他有利细菌生长的条件。（三）操作规程1.分纯细菌，18-24小时培养物（新鲜菌）2.根据细菌选卡片，恢复室温。3.按表一建议配制菌悬液4.根据自身需要选择药敏卡。5.在SCS操作台完成初步资料输入。6.船架放入仪器，关闭外门。7.仪器自动完成核对，稀释，填充，切割，封闭及上卡，卸卡。八、细菌的分离鉴定程序标本的采集与送检应注意的问题：1、注意无菌操作，避免正常菌群污染；2、根据致病菌在体内分布和排出部位不同采取标本；3、应在使用抗生素前采标本；4、采集病变明显部位；5、尽快送检；6、多数菌可冷藏送检，但不耐寒冷的脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等要保暖送检；粪便标本置于甘油缓冲盐水保存液中。检验程序脓汁、脑脊液血液胸、腹水粪便、呕吐物等分离培养纯培养涂片染色生化反应血清学鉴定药敏试验动物实验增菌培养涂片染色