ITS在区分疑似黄鹌菜上的应用

吉首大学JISHOUUNIVERSITY2010届毕业论文题目：ITS在区分疑似黄鹌菜上的应用学生姓名：余玉良学号20064074006学院：生物资源与环境科学学院专业年级：06级生物科学（师范）指导教师：恩特马克∙布拉提白写作时间：2010年5月目录摘要………………………………………………………………………………………………….1关键词……………………………………………………………….….………………………………...1Abstract………...………………………………………………...……………………………………….1Keywords………………………………………………………………………………………………….2前言………………………………………………………………..………………………………….21材料和方法：……………………………………………………………………………………………31.1材料….………………..……………………………………………………………………………….31.1.1材料来源………………………………………………………………………………………….31.1.2主要试剂………………………………………………………………………………………….31.2方法………………….……………………………………………………………………………….31.2.1实验材料的采集、洗涤与称量………………………………………………………………….31.2.2样品总DNA的制备……………….…………………………………………………………….31.2.3样品rRNA基因ITS序列PCR扩增.………….……………………………………………….41.2.4ITS序列分析…………………………………………………………………………………….42实验结果………..…………………………………………………………………………………….42.1.黄鹌菜和异叶假福王草总DNA的制备…………………………………………………………….42.2ITS序列扩增结果…….…………………………………………………………………………….52.3序列及结构分析结果…..…………………………………………………………………………….52.4同源性分析………….……………………………………………………………………………….73讨论……………..…………………………………………………………………………………….8参考文献..………………………………………………………………………………………………….9吉首大学毕业论文1ITS在区分疑似黄鹌菜上的应用作者：余玉良指导老师：恩特马克·布拉提白（吉首大学生物资源与环境科学学院中国吉首416000）摘要：本研究通过ITS序列对四种菊科植物进行了同源性分析。首先采用改良CTAB法提取总DNA，利用通用引物ITS5和ITS4）经PCR扩增出ITS序列并进行测序。在NCBI数据库中对测序结果进行同源性比对，调取同源性较高的ITS序列，通过聚类分析软件构建进化树。结果表明,四组样品5.8SrDNA序列显示高度的一致性。多态性位点大部分分布于ITS1和ITS2中，且ITS1中的多态性位点高于ITS2。基于ITS序列的系统发育树表明，聚类分析结果与形态学分类结果一致，说明ITS可以作为菊科植物种属、居群间的聚类分析指标。关键词：菊科；福王草；黄鹌菜；PCR；ITS序列AplicationofITSonDistinguishingSeemingYoungiajaponicaYUYu-liangSupervisor:EntomackBorrathybay(CollegeofBiologyandEnvironmentalScience，JiShouUniversity，JiShou，China，416000)Abstract:HomologyanalysisofITSSequencesfromParaprenanthesprenanthoidesandYoungiajaponicaonWesternHunan.TotalDNAwereexstractedwithusingthemethodofCTAB，ITSfragmentswasamplifiedusingPCRwithspecificITS5andITS4，andthensequenced.HomologycomparationweredonetothetestedsequenceinNCBIdatabase,relatedgenesequenceswerepickedupthegenestructureanalysisedandwithclusteranalysissoftware,evolutionarytreewereformed.Theresultshowedthat5.8SrDNAofthetwospeciesareofalmosttheconservative.mostofthepolymorphiclociarelocatedinITS1andITS2,andtherearemorepolymorphiclociin吉首大学毕业论文2ITS1thaninITS2.theresultofclusteringanalysisarethesametotheresultsofclassificationofmorphologywhichmeanthatITScanbeasaguidelinetoclusteringanalysisofCompositaeKeywords:Compositae,Paraprenanthesprenanthoides,Youngiajaponica,PCR,ITSSequences前言菊科为被子植物一大科，全世界约有1000属，25000～30000种，世界广布，我国约有233属，约3000种。黄鹌菜（Youngiajaponica）为菊科黄鹌菜属植物，一年生草本，叶倒披针形，顶端钝圆或急尖，提琴状羽裂，顶端裂片较两侧裂片稍大，裂片边缘有不规则细齿，无毛或有稀疏细软毛，花茎上无叶或有一至数退化至羽状分裂叶片，有基生叶和茎生叶两种叶。生于山坡、山谷林缘、林下、林间草地及潮湿地、河边沼泽地、田间与荒地上。异叶假福王（Paraprenanthesprenanthoides）为菊科假福王草属植物，一年生草本，茎单生，直立，生于山坡林下，海拔500-1100米。在传统分类学上，两属之间亲缘关系较密切[1]。植物基因组因其结构和功能上的差异，进化速率有所不同。核基因组(nDNA)进化最快，约为叶绿体基因组(cpDNA)的2倍，线粒体基因组(mtDNA)进化最慢，还不到叶绿体基因组的1/3[2]。但由于cpDNA的进化速率远远低于nDNA，限制了其在较低分类阶元（如属、亚属）中的应用。因此，众多的研究者将注意力集中到nDNA中进化较快的DNA序列上，18S-26S核核糖体DNA（nrDNA）的内转录间隔区ITS(Internaltranscribedspacer)正是符合要求的序列之一[3]。ITS序列位于1.8S和2.6SrDNA之间，被5.8SrDNA分为2段，即ITS1和ITS2。ITS在核基因组中是高度重复的，而且通过不等交换和基因转换，这些重复单位间已发生了位点内或位点间的同步进化(concertedevolution)。被子植物与其它高等真核生物相似，核rDNA是高度重复的串联序列由于同步进化的力量，绝大多数物种中这些重复单位间已发生纯合或接近纯合。ITS序列相对保守又有一定变异，可以提供较丰富的变异位点和信息位点，已证实它是研究许多被子植物类群系统与进化的重要分子标记[4-5]。而且有报告指出，在被子植物中ITS作为18S~26SrDNA的一部分高度重复。并且又有一定的变异性和长度上的保守性[7]，被子植物吉首大学毕业论文3大多数科属其ITS序列的种间差异比较小，这就不仅对PCR扩增产物直接测序奠定了理论基础，而且很容易在近缘类群间排序。被子植物ITS长度（包括ITS1、ITS2和5.8SrDNA）通常为565~700bp为测序带来很大方便[8]。不同ITS拷贝间的序列趋于相近或完全一致，这就为对PCR扩增产物直接测序奠定了理论基础。同时国内也有很多学者利用ITS对植物分类进行了研究[6-9]。这些研究项目也为我们研究奠定了合理可信的理论基础。本项目利用改进的CTAB法[10]进行总DNA提取，并利用nrDNA的ITS对湘西地区两属的常见种黄鹌菜及异叶假福王草的序列进行比较分析，旨在探讨其种间的遗传变异以及它们之间的亲缘关系，为菊科内不同属植物系统学研究提供资料。1材料和方法：1.1材料1.1.1材料来源实验所用的四组样品均由张代贵老师提供，其中三组为黄鹌菜属植物分别编号为1、2、3、还有一组为异叶假福王草属植物编号为4。1号为采自吉首德夯的戟叶黄鹌菜（Youngialongipes），2号为采自永顺小溪的戟叶黄鹌菜（Youngialongipes），3号为采自吉首大学新校区的黄鹌菜（Youngiajaponica）。4号为采自永顺杉木河的疑似异叶假福王草（Paraprenanthesprenanthoides）。1.1.2主要试剂Taq酶、λDNA/HindIIIDNAMarker、DL2000Marker均购自大连宝生物工程有限公司；无水乙醇、CTAB、氯仿、异丙醇、异戊醇、乙醇、电泳琼脂、RNAse、Tris、EDTA均为分析纯。1.2方法1.2.1实验材料的采集、洗涤与称量根据实验目的适当选取材料，不取有伤口的或有病虫的材料。实验所需的材料是叶的部分。将采集的叶片，在超声波洗涤机上清洗3分钟。而后用清水洗净，用滤纸吸干，再称取实验所需的的样品叶片。1.2.2样品总DNA的制备[11]吉首大学毕业论文4本项目采用鲜叶提取，具体操作：将40mg叶片组织用无水乙醇浸泡60分钟；用研钵将组织研碎；将磨碎的组织加入850μL预热的CTABbuffer，60℃水浴1小时，期间轻微混合；加0.6倍体积的氯仿/异戊醇（24：1）。颠倒混合15分钟；14000rpm离心10分钟，转上清液至一新管中；加0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，14000rpm离心15分钟沉淀DNA；70%乙醇洗涤沉淀，倒置离心管于滤纸上1小时，过夜干燥；加500μLTE溶解DNA，再加2.5μLRNA酶；轻柔混匀，37℃水浴1小时；加0.3-0.4mL氯仿/异戊醇（24：1），混合15分钟，14000rpm离心15分钟；取上清，用两倍体积无水乙醇沉淀DNA，14000rpm离心15分钟沉淀DNA；70%乙醇洗涤沉淀，干燥过夜；加50μLTE溶解DNA；然后测OD（opticaldelnsity）λ260定量浓度；通过λ280和λ260的比率确定DNA纯度；用0.6%琼脂糖凝胶电泳检测DNA。1.2.3样品rRNA基因ITS序列PCR扩增取OD值比较理想的总DNA为模板，反应体系如下：双蒸水38.25L；10×PCRbuffer5L；dNTPs4L；PITS50.75L；PITS40.75L；Taq0.25L；模板DNA1L；总体系50L。PCR反应条件为：95℃条件下使模板DNA变性5min；95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min。通过1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。1.2.4ITS序列分析将PCR扩增产物送往上海生工生物工程公司进行测序。利用测序结果在NCBI上通过Blast搜索程序进行同源性比对，并下载相关的ITS序列，并分析目的基因结构。将所有基因序列用CLUSTALX进行多序列比对，利用BioEdit程序和MEGA3.1软件聚类分析，按照邻接法（neighbor-joiningmethod）构建系统发育进化树。2实验结果2.1.黄鹌菜和异叶假福王草总DNA的制备利用改进的CTAB法提取的总DNA经0.6%的琼脂糖凝胶电泳分