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微生物實驗教材微生物實驗教材網頁連結題目：環境中微生物的觀察目的讓學生瞭解環境中有許多的微生物，可能會造成微生物實驗的污染，希望學生在往後的實驗裡能做好無菌的操作，避免污染。材料營養瓊脂平板培養(NA,nutrientagar)實驗步驟：用油性簽字筆先將培養皿劃分成兩區，標示組別、座號、日期、培養基種類（此次的培養基為營養瓊脂平板培養基nutrientagarplates，簡稱NA），將手指輕按於培養基的一區上另外有一平板培養基，將蓋子打開，於空氣中暴露30分鐘將平板培養基倒置放於室溫中，培養24-48小時。觀察平板培養基所長出的菌落，互相比較並計算其數目。試著依大小、形狀、表面狀況、高度、顏色、邊緣等，描述幾個不同之菌落，菌落之外表特徵，可供菌種鑑定時的參考。微生物實驗無菌操作常用器材『接種環』微生物實驗無菌操作常用器材『酒精燈』微生物實驗無菌操作消毒殺菌器材『70％酒精』塑膠培養皿培養基-營養肉湯瓊脂（洋菜膠）使培養基固化Broth（肉湯）液態培養基Slant斜面培養基題目：細菌的接種與純培養目的本次實驗中讓學生練習平板劃線技術(Streak-PlateTechnique)，分離單一菌落藉由此實驗學習基本的無菌操作觀念，與純培養將沾有菌種的接種環在培養基表面劃線，在劃線過程中，細胞逐漸分散，培養後形成單個菌落。材料營養瓊脂平板培養(NA,nutrientagar)接種環、酒精燈菌種大腸桿菌Escherichiacoli枯草桿菌Bacillussubtilis金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus實驗步驟用油性簽字筆先將培養皿標示組別、座號、日期，另外逆時針標示三區（I、II、III，每一區大約差60~90度）及中間第四區IVIIIIIIIV將接種環前端的環區置於酒精燈上燒紅，放於酒精燈旁冷卻（要確實冷卻），以冷卻的接種環沾取一些菌落。（所以動作儘量在酒精燈周圍）打開培養皿，於第I區輕輕來回塗抹均勻（接種環盡量與培養皿成水平，比較不會劃破培養基），蓋上培養皿。再將接種環用酒精燈燒紅、冷卻。打開培養皿，將培養皿逆時針轉約60~90度，自第I區的尾部，單方向畫線拖往第II區，大約劃8-10條線。蓋上培養皿。再將接種環用酒精燈燒紅、冷卻。打開培養皿，將培養皿逆時針轉約60~90度，自第II區的尾部，單方向畫線拖往第III區，大約劃5-10條線。接種環不燒紅，培養皿再逆時針轉約60~90度，直接從第III區的尾部以Z字形拉線到第四區。接種環需再燒紅一次滅菌。I區III區II區IV區平板劃線技術(Streak-PlateTechnique)題目：影響細菌生長的因素：溫度、pH值目的：本次實驗中讓學生再次練習平板劃線技術(Streak-PlateTechnique)，分離單一菌落與複習無菌操作觀念給學生練習液態培養基的接種技術與斜面培養基的接種方法平板培養基將培養於不同溫度，觀察溫度對細菌生長的影響液態培養基（或稱為肉湯）則是含有不同的pH值，可觀察pH值對細菌生長的影響材料：營養瓊脂平板培養(NA,nutrientagar)液態培養基(broth)接種環、酒精燈菌種（大腸桿菌Escherichiacoli）實驗步驟：四區畫線法的步驟如前所述。液態培養基的接種，將接種環燒紅之外，上面鐵棒部分也要燒過，放於酒精燈旁冷卻（要確實冷卻），沾取一些菌落。將試管蓋口輕輕過火，以右手小拇指打開蓋子，將接種環深入試管底部，輕輕攪拌一會。拿出接種環，瓶口過火，蓋子過火，蓋子套回試管，再過火，接種環需再燒紅一次滅菌。斜面培養基的接種，類似液態培養基接種方法，只有畫菌方式不同。接菌方式如上所述，沾到菌之後將接種環深入試管底部，從下往上慢慢Z字型畫線。拿出接種環，瓶口過火，蓋子過火，蓋子套回試管，再過火，接種環需再燒紅一次滅菌。固態培養基將培養於45℃、37℃、25℃、4℃，液態培養基置於37℃震盪培養。題目：細菌數量的計數方法-平板塗佈法（SpreadPlate）目的常用來計算每ml液體培養基中的細菌數量有三種血球計數器計直接數法、平板計數法、濾膜培養法本次實驗中讓學生練習以平板塗佈法來計數細菌的數量。此種方法簡單、靈敏，廣泛應用於食品、水體及土壤樣品中活的細菌的計數平板計數法得到的結果稱為菌落形成單位(colonyformingunit，CFU)CFU並不完全等同於樣品中的活菌數，菌落數在30-300個內，所計數的結果會較正確材料營養瓊脂平板培養(NA,nutrientagar)液態培養基(broth)L型玻棒、酒精燈菌種（大腸桿菌Escherichiacoli）與所使用的稀釋倍數菌液實驗步驟用油性簽字筆先將培養皿標示組別、座號、日期，與所使用的稀釋倍數菌液。將隔夜培養的大腸桿菌菌液做連續性的稀釋（包含10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，此部分由老師實驗前先準備）。以微量吸管取100ml稀釋菌液加於培養基的中央。將玻棒浸入95%酒精中，將沾附酒精的玻棒稍用火燒並放置酒精燈下方使其『冷卻』（酒精燈與95%酒精要離遠一點，不要讓火滴到酒精中）。用冷卻的玻棒把菌液均勻塗佈於平板表面上，塗佈的時候只需將培養基稍微打開，邊推邊轉動培養基，盡量塗均勻及避免污染。塗佈到菌液乾掉為止（這樣才可倒置培養）。有時會不容易推乾，可置於無菌操作台吹乾，培養於37℃隔夜。總菌數的計數培養基菌落數/0.1ml/稀釋倍數例如：所使用的稀釋度為10-5，平板長出的菌落數平均為200個，則原培養液中可能的菌數含量為？200/0.1ml/10-5=200x106=2x108平板塗布技術(Spread-PlateTechnique)1.將少量的菌液用微量吸管滴在平板中央2.將玻棒侵入酒精中3.將沾附酒精的玻棒稍用火燒並放置使其『冷卻』4.用玻棒把菌液均勻塗佈於平板表面上培養題目：細菌的鑑別染色法-革蘭氏染色法（Gramstain）目的藉由此實驗讓學生練習細菌的鑑別染色方法，革蘭氏染色可將細菌區分為革蘭氏陽性菌及陰性菌。原理鑑別染色需要先將細菌熱固定於玻片上，利用四種化學藥劑結晶紫為初染劑，使細菌著色，細菌呈現藍紫色革蘭碘為媒染劑，加強結晶紫的染色效果95%的酒精為脫色劑，脫去初染劑的顏色，也是關鍵步驟番紅為複染劑，與初染呈對比顏色因為細胞壁結構不一樣，革蘭氏陽性菌會被染成藍紫色，而革蘭氏陰性菌則被染成紅色。革蘭氏染色法四種化學藥劑的作用原理初染劑：結晶紫(Crystalviolet)是一種鹼性溶劑，可與細胞壁中的胜肽聚醣緊密結合，使細菌染成藍紫色。媒染劑：革蘭碘液(Gram'siodinesolution)，可與結晶紫結合形成不溶性複合物，加強結晶紫的顏色。脫色劑：95%酒精，酒精可溶解掉革蘭氏陰性菌細胞壁中外層的脂多醣（LPS），而使的結晶紫釋出，使菌體成無色。革蘭氏陽性菌細胞壁之脂質含量低，酒精很難讓結晶紫完全釋出，因而保留了藍紫色，但若脫色時間太久也會導致菌體成無色。複染劑：番紅(safranin)可將脫成無色的革蘭氏陰性菌染成紅色，而革蘭氏陽性菌因保有初始的藍紫色，番紅無法將其再染色。材料液態培養菌液大腸桿菌Escherichiacoli枯草桿菌Bacillussubtilis宜使用培養16~24小時之細菌。因菌齡老化，革蘭氏陽性菌之胜肽聚醣易失去保留初染劑結晶紫的能力，而使的份菌體染呈藍紫色，部份呈紅色。玻片、顯微鏡、試鏡紙、酒精燈染劑結晶紫、革蘭碘、95%酒精、番紅實驗步驟以試鏡紙將玻片擦乾淨，以簽字筆在玻片背面畫一個小圓圈。使用接種環取一點菌液（環部分形成一薄膜），塗抹於玻片中央，將接種環再燒紅滅菌。大腸桿菌（EC）與枯草桿菌（BS）分別取，於空氣中乾燥，熱固定（玻片背面用火烤一下）。滴結晶紫覆蓋塗抹區，靜置一分鐘，以RO水輕洗。（在水槽邊操作）滴革蘭碘試劑染一分鐘，以RO水輕洗。以95%酒精脫色，將玻片放傾斜，酒精逐滴滴下，勿脫色過頭，以蒸餾水輕洗。滴番紅試劑染染45秒，以蒸餾水輕洗。以吸水紙吸乾水分或陰乾，以100倍油鏡觀察。E.coliGramstainB.nattoGramstain題目：控制微生物生長之化學治療劑-細菌對抗生素敏感性(感受性)測試目的利用(disc-agardiffusion)了解Kirby-Bauer試驗法，以了解化學治療劑之抗微生物作用。原理臨床上最常用來治療細菌性感染疾病的化學治療藥為劑為抗生素（antibiotics）本實驗利用自製的紙錠，其含有不同的抗生素：ampicillin、kanamycin、chloramphenicol、tetracyclineKirby-Bauer法為一種標準的紙錠瓊脂擴散法，用於測試細菌對藥物感受性，藉由量測抑制環之大小來判讀細菌對抗生素的感受性。材料液態培養菌液三種不同的大腸桿菌Escherichiacoli抗生素敏感性抗ampicillin抗kanamycin酒精燈、無菌棉花棒、培養皿、鑷子、紙錠實驗步驟將培養皿畫成四區，在三區周圍標上amp,kan,tetra，寫上組別與座號。含菌液試管過火，打開蓋子，使用無菌棉棒沾取某一種大腸桿菌菌液，於試管內將多餘的菌液擠掉。棉花棒來回均勻塗佈於整片培養基表面，培養基轉90度再均勻塗佈一次。將尖嘴鑷子沾一些酒精，過火、冷卻、輕夾取一紙錠，將其『輕壓』緊貼於瓊脂表面。每一區放一種紙錠。將培養基倒置，於37℃培養隔夜。觀察細菌的生長是否受抑制。紙錠周圍會形成一透明環，測量抑制環之大小(mm)與標準表格比較，即可得知此細菌的感受性為抗性（resistant）、中間（intermediate）或敏感性（sensitive）。感受性的實驗受到許多因素的影響，如：培養基的種類（不同品牌間會有差異）、紙錠的材質（影響擴散的速率），受測菌株之接種量、生長速度與品系等。因本實驗紙錠為自製，培養基也非標準的Mueller-Hintonagar，所以不能由結果判斷菌株對抗生素是感受性或抗性。ampicillin(安比西林)的作用為抑制細胞壁的合成，屬於青黴素類的抗生素；kanamycin(卡那黴素)屬於胺基糖甘類（aminoglycoside），干擾細菌tRNA結合至30S核糖體次單位，沒有胜肽鍵形成；chloramphenicol(氯黴素)抑制50S核醣體的肽基轉移酵素；tetracycline(四環黴素)防止胜肽在30S核醣體延長。E.coliTop10FstrainE.coliTop10F/pUC18strain題目：土壤中放線菌的篩選與放線菌抗菌活性分析目的：從土壤樣品中篩選放線菌，掏選幾株放線菌測試其抑制其他細菌生長的能力原理：現今臨床上所使用的抗生素有三分之二來自放線菌所生產，而放線菌普遍存於土壤當中，土壤中的養分通常很貧瘠，所以本實驗所使用的篩選培養基一不含養分的水瓊脂培養基(wateragar)，另一培養基為十分之一的營養培養基，可以用來篩選土壤中的一般細菌。土壤中也存在許多真菌，為了避免真菌的生長，培養基中添加了抗生素-環己胺（cycloheximide,抑制真核細胞蛋白質合成），避免真菌的生長。材料：土壤樣本、無生理食鹽菌水、酒精燈、L型玻棒、水瓊脂培養基(wateragar)、1/10營養培養基，菌株若干株。實驗步驟：秤土壤1g放入9ml生理食鹽水中，震盪混合，做10倍連續稀釋成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5（此部分由老師實驗前先準備）。將培養基標示好座號、組別、種類。以微量吸管取100ml稀釋菌液加於培養基的中央。將玻棒浸入95%酒精中，將沾附酒精的玻棒稍用火燒並放置酒精燈下方使其『冷卻』（酒精燈與95%酒精要離遠一點，不要讓火滴到酒精中）。用冷卻的玻棒把菌液均勻塗佈於平板表面上，塗佈的時候只需將培養基稍微打開，邊推邊轉動培養基，盡量塗均勻及避免污染。塗佈到菌液乾掉為止（這樣才可倒置培養）。有時會不容易推乾，可置於無菌操作台吹乾，培養於室溫中3~4天。觀察不同培養基所長出的菌落型態。題目：真菌的接種、培養與觀察目的：了解