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绪论1680年列文虎克制成显微镜───证明了微生物的存在。1857年，巴斯德（LouisPasteur）微生物之父证明了酒精是由活的酵母发酵引起的。并提出了著名的发酵理论：一切发酵过程都是微生物作用的结果。1897年德国化学家毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精───酶1905年，柯赫建立微生物纯培养技术，为微生物学的发展奠定了基础。科赫的固体培养基也是微生物学研究史上的一大突破。第一章生产菌种的筛选1、工业化菌种的要求有哪些？①遗传性能要相对稳定，不易变异退化；②能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物；③抗病毒能力强，不易感染它种微生物或噬菌体；④产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，包括抗生素、激素和毒素等，保证安全）；⑤有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强；⑥生产特性要符合工艺要求（如生长速度和反应速度较快，发酵周期短等）。⑦培养和发酵条件温和（糖浓度、温度、pH、溶解氧、渗透压等）2.在工业生产中常用的微生物主要有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌3、自然界分离微生物的一般操作步骤？从环境中分离目的微生物时，为何一定要进行富集培养？样品的采集-预处理—培养—培养—菌落的选择—出筛—复筛—性能的鉴定—菌种保藏富集培养的原因：自然界中目的微生物含量很少，非目的微生物种类繁多，进行富集培养，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，使筛选变得可能。4.每克土壤的含菌量大体上有一个十倍系列的递减规律：细菌（～108）＞放线菌（～107）＞霉菌（～106）＞酵母菌（～105）＞藻类（～104）＞原生动物（～103）第二章微生物的代谢调节和控制1、酶活性调节的反馈抑制类型和抑制机制。反馈抑制——主要表现在某代谢途径的末端产物过量时可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性，促使整个反应过程减慢或停止，从而避免了末端产物的过多累积。主要表现在氨基酸、核苷酸合成途径中。特点：作用直接、效果快速、末端产物浓度降低时又可解除同功酶的主要功能在于其代谢调节。在一个分支代谢途径中，如果在分支点以前的一个较早的反应是由几个同功酶所催化时，则分支代谢的几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用协同反馈抑制：指分支代谢途径中的几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式。③增效反馈抑制：系指两种末端产物同时存在时，可以起着比一种末端产物大得多的反馈抑制作用。累积反馈抑制：每一分支途径的末端产物按一定百分率单独抑制共同途径中前面的酶，所以当几种末端产物共同存在时，它们的抑制作用是累积的。⑤顺序反馈抑制：当E过多时，可抑制C→D，这时由于C的浓度过大而促使反应向F、G方向进行，结果又造成了另一末端产物G浓度的增高。由于G过多就抑制了C→F，结果造成C的浓度进一步增高。C过多又对A→B间的酶发生抑制，从而达到了反馈抑制的效果。这种通过逐步有顺序的方式达到的调节，称为顺序反馈抑制联合激活或抑制调节一种中间产物参与2个独立的代谢过程，其浓度影响2个代谢，存在激活抑制的联合调节。2、大肠杆菌的乳糖操纵子模型中包含几部分？结构基因、启动基因、操纵基因、调节基因3、微生物细胞初级代谢的调节有哪两种类型？4、次级代谢产物、初级代谢产物初级代谢产物是指微生物通过代谢活动产生的，生长和繁殖所必需的物质，如蛋白质、核酸等。次级代谢产物是指微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。5、酶的诱导和阻遏诱导(induction)：是酶促分解底物或产物诱使微生物细胞合成分解代谢途径中有关酶的过程。根据酶的生成与环境中是否存在酶的底物或其有关物，可把酶划分成组成酶和诱导酶两类。组成酶：不依赖酶底物而合成的酶，如：EMP途径的一些酶。微生物细胞内一直存在，合成是受遗传物质控制。诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物通过诱导作用而临时合成的一类酶。如E.coli在含乳糖的培养基中合成β-半乳糖苷酶和半乳糖苷渗透酶能促进诱导酶产生的物质称为诱导物，它可以是该酶的底物，也可以是难以代谢的底物类似物或是底物的前体物质。酶的诱导合成类型同时诱导：即当诱导物加入后，微生物能同时或几乎同时诱导几种酶的合成，它主要存在于短的代谢途径中。例如，将乳糖加入到E．coli培养基中后，即可同时诱导出β-半乳糖苷透性酶、β-半乳糖苷酶和半乳糖苷转乙酰酶的合成；顺序诱导：即先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调节。（二）酶合成的阻遏阻遏（repression）：在微生物的代谢过程中，当代谢途径中某末端产物过量时，除可用前述的反馈抑制的方式来抑制该途径中关键酶的活性以减少末端产物的生成外，还可通过阻遏作用来阻碍代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的生物合成，从而更彻底地控制代谢和减少末端产物的合成。阻遏作用有利于生物体节省有限的养料和能量。阻遏的两种类型：1、末端产物阻遏末端产物阻遏（end-productrepression）指由某代谢途径末端产物的过量累积而引起的阻遏。对直线式反应途径来说，末端产物阻遏的情况较为简单，即产物作用于代谢途径中的各种酶，使之合成受阻遏，例如过量的精氨酸阻遏了参与合成精氨酸的许多酶的合成。2、分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏（cataboliterepression）：指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。最早发现于大肠杆菌生长在含葡萄糖和乳糖的培养基时,葡萄糖分解代谢物阻遏乳糖分解酶而出现“二次生长（diauxicgrowth）”。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。因此，分解代谢物的阻遏作用，就是指代谢反应链中，某些中间代谢物或末端代谢物的过量累积而阻遏代谢途径中一些酶合成的现象。第三章优良菌种的选育1、经常用于菌种的初筛的方法有哪些？各有什么特点？菌种选育中常用的三种培养基①初筛常用的方法：平皿快速检测法a.是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的“形态”变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等。b.这些方法简单，快速，可大大提高筛选的效率。但缺点是较粗放，一般只能定性或半定量用；而且由于培养平皿上的条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养的条件差别很大，有时会造成两者结果不一致。c.平皿快速检测法操作时应注意将培养的菌体充分分散，以形成单菌落，避免多菌株混杂一起，引起“形态”大小测定的偏差。•1）纸片培养显色法：将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。•2）变色圈法：将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或将指示剂喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。•3）透明圈法:在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。接种后待筛选的菌落周围会形成透明圈，透明圈的大小反映了菌落利用此物质的能力。•在培养基中掺入可溶性淀粉、酪素或CaCO3可以分别用于检测菌株产淀粉酶、产蛋白酶或产酸能力的大小。•4）生长圈法:利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，若待分离的菌在缺乏上述营养物的条件下，能合成该营养物，或能分泌酶将该营养物的前体转化成营养物，那么，在这些菌的周围就会有工具菌生长，形成环绕菌落生长的生长圈。•该法常用来选育氨基酸、核苷酸和维生素的生产菌。工具菌往往都是对应的营养缺陷型菌株。•5）抑制圈法：•待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质，或能分泌某种酶并将无毒的物质水解成对工具菌有毒的物质，从而在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。菌种选育中常用的三种培养基：1）基本培养基（MM)：仅能满足某微生物的野生型或原养型菌株生长需要的最低成分组合培养基。不同微生物的基本培养基成分差别比较大。［-］2）完全培养基(CM)：可满足某种微生物一切营养缺陷型菌株营养需要的培养基。通过将富含各种氨基酸、维生素、碱基的天然物质（如牛肉膏、蛋白胨、麦芽汁）加入基本培养基中制成。［+］3）补充培养基(SM)：只能满足某种微生物的一种或几种营养缺陷型及野生型菌株生长需要的培养基。一般由基本培养基加入相应营养成分构成。2、最为常用的物理诱变剂是什么？紫外诱变的有效波长范围及注意事项？物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线，快中子；•紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为253.7nm．灯与处理物的距离为15～30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。•被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个／ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个／ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。•由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。3、诱变育种？回复突变？诱变育种：利用各种诱变剂（能够提高生物体突变频率的物质，如物理因素和化学试剂）处理微生物细胞，提高基因突变效率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降的现象。4、自然选育的特点？优点：简单易行，自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。缺点：效率低，进展慢，不能满足育种工作要求；发生负向突变，表现为菌株的衰退和生产质量的下降的几率更高。5、选育发酵高产菌种的方法包括基因突变育种和基因重组育种,其中后者包括基因工程育种、杂交育种、和原生质体融合育种。第四章菌种的保藏及种子的扩大培养1、各种菌种保藏方法的保藏原理、适用范围和时间长短。①定期移植法：将斜面培养、液体培养或穿刺培养好的菌种，置于4-6℃冰箱保存，定期移植到新的培养基上生长后继续保藏。一般保存期3-6个月。保存的温度和时间各菌种不一②隔绝空气法该法是定期移植法的辅助方法。用170℃下灭菌1-2h的液体石蜡封住半固体穿刺培养物，在4-5℃冰箱中保藏，保存期6-12个月。适用于各种好气性、且不能以石蜡为碳源的菌种，如固氮菌、分枝杆菌、沙门氏菌、毛霉、根霉等。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。原理：利用低温、缺氧抑制微生物代谢，推迟细胞老化，防止培养基水分蒸发，从而延长微生物的寿命。③沙管保藏法、土壤保藏法原理：利用干燥、低温、隔氧、无营养物的条件保藏菌种。土壤是自然界微生物的共同活动场所，土壤颗粒对微生物具有一定的保护作用。保藏期：4-5℃冰箱保藏，也可常温下保存，时间可达数年，甚至数十年。特点：保藏的效果较好，制作也简单，比液体石蜡法保藏时间长。适用菌种：产孢子的丝状真菌和放线菌以及产芽孢的细菌。方法：取河沙过24目筛，用10~20%的盐酸浸泡除去有机质，洗涤，烘干，分装入安瓿管，加塞灭菌。需要保藏的菌株先用斜面培养基培养，再用无菌水制成细胞或孢子悬液，将10滴悬液注入装有洗净、灭菌河沙的沙管内，使细胞或孢子吸附在沙上，放到干燥器中吸干沙中的水分，将干燥后的沙管用火焰熔封管口。可以室温或低温保藏。土壤法以土壤代替河沙，不需酸洗，经风干、粉碎、过24目