微生物检测实验指导(XXXX版)

1食品微生物实验指导刘后伟、林丹琼、刘旭光适合专业：绿色食品加工专业食品营养与检测专业农产品检测专业实训一显微镜的操作与使用实验1:显微镜的构造、性能和使用方法1.目的要求(1)熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能。(2)学习并掌握油镜的原理和使用方法。2.基本原理显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成。2油镜物镜的基本原理微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜（16mm，10×）、高倍物镜（4mm，40—45×）和油镜（1．8mm，95—100×）三种。油镜通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI字样表示，它是三者中放大倍数最大的。根据使用不同放大倍数的目镜，可使被检物体放大1000—2000多倍。油镜的焦距和工作距离（标本在焦点上看得最清晰时，物镜与样品之间的距离）最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=1．52，与玻璃相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样就减低了视野的照明度。利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径，因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称为镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示：NA＝n·sinα式中NA=数值孔径；n=介质折射率；α=最大入射角的半数，即镜口角的半数。3因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈大（图Ⅲ-5），该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时，α的理论限度为90°，sin90°=1，故以空气为介质时（n=1），数值孔径不能超过1，如以香柏油为介质时，则n增大，其数值孔径也随之增大。如光线入射角为120°，其半数的正弦为sin60°=0．87，则：以空气为介质时：NA=1×0．87=0．87以水为介质时：NA=1．33×0．87=1．15以香柏油为介质时：NA=1．52×0．87=1．32显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值孔径成正比，与光波长度成反比。因此，物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，则显微镜的分辨力愈大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。因此，一个高的分辨力意味着一个小的可分辨距离，这两个因素是成反比关系的，通常有人把分辨力说成是多少微米或纳米，这实际上是把分辨力和最小分辨距离混淆起来了。显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示的。式中λ=光波波长。我们肉眼所能感受的光波平均长度为0．55μm，假如数值孔径为0．65的高倍物镜，它能辨别两点之间的距离为0．42μm。而在0．42μm以下的两点之间的距离就分辨不出，即使用倍数更大的目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用数值孔径更大的物镜，增加其分辨力才行。例如用数值孔径为1．25的油镜时，能辨别两点之间的因此，我们可以看出，假如采用放大率为40倍的高倍物镜（NA=0．65），和放大率为24倍的目镜，虽然总放大率为960倍，但其分辨的最小距离只有0．42μm。假如采用放大率为90倍的油镜（NA=1．25），和放大率为9倍的目镜，虽然总的放大率为810倍，但却能分辨出0．22μm间的距离。3.材料及器材显微镜、擦镜纸、二甲苯、香柏油、微生物制片标本等。4.方法与步骤(1)观察前的准备A.置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约3—4cm。镜检者姿势要端正，一般用左眼观察，右眼便于绘图或记录，两眼必须同时睁开，以减少疲劳，亦可练习左右眼均能观察。B.调节光源，对光时应避免直射光源，因直射光源影响物像的清晰，损坏光源装置和镜头，并刺激眼睛。如阴暗天气，可用日光灯或显微镜灯照明。调节光源时，先将光圈完全开放，升高聚光镜至与载物台同样高，否则使用油镜时光线较暗。然后转下低倍镜观察光源强弱，调节反光镜，光线较强的天然光源宜用平面镜；光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜。在对光时，要使全视野内为均匀4的明亮度。凡检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线。(2)低倍镜观察检查的标本需先用低倍镜观察，因为低倍镜视野较大，易发现目标和确定检查的位置。将金黄色葡萄球菌染色标本置镜台上，用标本夹夹住，移动推动器，使观察对象处在物镜正下方，转动粗调节器，使物镜降至距标本约0．5cm处，由目镜观察，此时可适当地缩小光圈，否则视野中只见光亮一片，难见到目的物，同时用粗调节器慢慢升起镜筒，直至物像出现后再用细调节器调节到物像清楚时为止，然后移动标本，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，并将其移至视野中心，准备用高倍镜观察。(3)高倍镜观察将高倍镜转至正下方，在转换物镜时，需用眼睛在侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后由目镜观察，并仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜，同时用粗调节器慢慢升起镜筒至物像出现后，再用细调节器调节至物像清晰为止，找到最适宜观察的部位后，将此部位移至视野中心，准备用油镜观察。(4)油镜观察A.用粗调节器将镜筒提起约2cm，将油镜转至正下方。B.在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。C.从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头。D.从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。E.用同样的方法观察枯草芽孢杆菌染色标本。F.观察完毕，上旋镜筒。先用擦镜纸拭去镜头上的油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留油迹，最后再用干净擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦净显微镜的金属部件。G.将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。5.实验作业(1)分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的状态，包括在三种情况下视野中的变化，同时注明物镜放大倍数和总放大率。(2)在使用高倍镜和油镜进行调焦时，应将镜筒徐徐上升还是下降？为什么？(3)用油镜观察时，为什么要在载玻片上滴加香柏油？5实训二培养基的配制和灭菌实验目的1.明确培养基的配制原理。2.掌握配制培养基的一般方法和步骤。实验内容学习细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物培养基的配制。实验原理培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。各类微生物对营养的要求不尽相同，因而培养基的种类繁多。培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，培养放线菌常用高氏I号培养基，培养霉菌常用蔡氏培养基或马铃薯培养基，培养酵母菌常用麦芽汁培养基或马铃薯葡萄糖培养基。另外还有固体、液体、加富、选择、鉴别等培养基之分。在这些培养基中，就营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。琼脂只是固体培养基的支持物，一般不为微生物所利用。它在96℃以上熔化成液体，而在45℃左右开始凝固成固体。在配制培养基时，根据各类微生物的特点，就可以配制出适合不同种类微生物生长发育所需要的培养基。培养基除了满足微生物所必需营养物质外，还要求有一定的酸碱度和渗透压。霉菌和酵母菌的pH偏酸；细菌、放线菌的pH为微碱性。所以每次配制培养基时，都要将培养基的pH值调到一定的范围。牛肉膏蛋白胨培养基配方牛肉膏3.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g水1000mLpH7.4~7.6高氏I号培养基配方可溶性淀粉20gNaCl0.5gKNO31gK2HPO4·3H2O0.5gMgSO4·7H2O0.5gFeSO4·7H2O0.01g6琼脂15—25g水1000mLpH7.4~7.6马铃薯培养基配方马铃薯（去皮）200g葡萄糖（或蔗糖）20g琼脂15~25g水1000ml自然pH察氏培养基配方蔗糖30gNaNO32gK2HPO41gKCl0.5gMgSO4·7H2O0.5gFeSO4·7H2O0.01g琼脂15~25g蒸馏水1000ml自然pH实验及器材牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/LNaOH,1mol/LHCl，KNO3，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，FeS04·7H2O，马铃薯，蔗糖等。试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，pH试纸(pH5.5~9.0)，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。实验步骤1．牛肉膏蛋白胨培养基配制方法(1)称量：按培养基配方比例依次推确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCL放人烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可按在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。(2)溶化：在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入己溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时．需不断7搅拌．以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影晌细菌生长。(3)调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH,边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用mol/LHCL进行调节。对于有些要求pH较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再调整PH。(4)过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下可以省去（本实验勿需过滤）。(5)分装按实验要求，可将配制的培养基分装人试管内或三角烧瓶内。1)液体分装：分装高度以试管高度的l／4左右为宜。分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。2)固体分装：分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。3)半固体分装：试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。图1-1培养基的分装A漏斗分装装置；B自动分装装置1铁架；2漏斗；3孔胶管；4弹簧夹；5玻璃；6流速调节；7装量调节；8开关分装过程中，注意不要使培养基沾在管(瓶)口上，以免沾污棉塞而引起污染。8(6)加塞图1-2棉塞的制作培养基分装完毕后，在试管口或三角烷瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等），棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物进入培养基，防止由此而引起的污染；另一方面保证有良好的通气性能，使培养在里面的微生物能够从外界源源不断地获得新鲜无菌空气。因此棉塞质量的好坏对实验的结果有着很大的影响。一只好的棉塞，外形应象一只蘑菇，大小、松紧都应适当。加塞时的棉塞的总长度的3/5应在口内，2/5在口外。(7)包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记