微生物检验(李鲁平)

2019/8/131临床微生物学检验沈阳市第六人民医院李鲁平电话：23393138E-mail：[e-mail]2019/8/132临床标本的采集与处理细菌形态学检查细菌的分离培养与接种技术细菌生化反应鉴定的理论基础医院感染的实验诊断抗菌药物敏感性试验32019/8/13一、微生物检查基本方法42019/8/13致病菌的检验程序标本直接涂片染色镜检分离培养与鉴定病原菌抗原检测其它检测形态、结构、染色性涂片镜检菌落特征生化反应药敏试验血清学反应沉淀反应协同凝集免疫荧光对流免疫电泳酶免疫测定免疫印迹细菌代谢产物（气相色谱）细菌核酸（PCR）噬菌体分离细菌素测定分子生物学技术动物试验52019/8/13一、微生物检查基本方法与诊断技术(一)细菌形态学检查法:1.显微镜检查法:①普通光学显微镜：②暗视野显微镜：③相差显微镜：④荧光显微镜：⑤电子显微镜：2.细菌标本染色法;①单染色法:用一种染料将细菌和周围物体染成同一种染色。②复染色法:用两种或两种以上染料染色的方法革兰染色；抗酸染色；62019/8/13(二)细菌的人工培养及生化实验1.细菌的人工培养法①培养基:根据用途分基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基、特殊培养基。根据物理性状分液体培养基、固体培养基、半固体培养基。②细菌接种法:③细菌培养法:需氧培养;厌氧培养;二氧化碳培养;微需氧培养。72019/8/132.细菌生物化学实验方法、种类及原理①糖分解产物实验糖发酵试验;葡萄糖代谢类型鉴别试验;七叶苷水解试验;淀粉水解实验;甲基红试验;V-P试验;ONPG试验.②蛋白质分解产物试验明胶液化试验;吲哚试验;硫化氢试验;尿素酶试验;苯丙氨酸脱氨酶试验;氨基酸脱羧酶试验.③碳源利用试验枸橼酸盐利用试验,丙二酸盐利用试验.④呼吸酶类试验氧化酶试验;触酶试验;硝酸盐还原试验.⑤其他生化试验脂酶试验;磷酸酶试验;DNA试验;凝固酶实验；胆汁溶菌试验82019/8/13细菌L型生长缓慢，营养要求高，对渗透压敏感，普通营养基上不能生长，培养时必须用高渗的含血清的培养基。细菌L型在高渗的含血清的培养基上生长后形成三种类型的菌落。(三)细菌L型的概念及检查法92019/8/13二、微生物学检验概述(一)标本采集种类与原则1)血液：一般在病人发热初期或高峰期采集，怀疑细菌性心内膜炎时，血培养不少于三次。一般为静脉血，成人采血量10—20ml，婴儿和儿童1—2ml。2)尿液：最好用导尿管收集尿液，要防止逆行性感染。3)粪便：取脓血或粘液的粪便置清洁容器中送检。排便困难者，可用直肠拭子采样。4)鼻咽拭子：5)痰：清晨第一口痰为宜，必须先用清水漱口，避免唾液混入。102019/8/136)脑脊液及其他：CSF应无菌操作进行腰椎穿刺；胸水、腹水、包液、滑囊液等用注射器无菌操作采集。7）眼,耳部标本：用无菌拭子采集，及时接种相应培养基。8)性传播疾病标本：男性采取尿道脓性分泌物，女性采取宫颈分泌物，供镜检及培养；梅毒取皮肤渗出物和淋巴穿刺液涂片；疱疹取疱内液体或刺破小疱后，用无菌拭子采样。9)创伤、组织、脓肿标本：根据不同部位采取不同标本。112019/8/13标本运送1）采集时间应在疾病早期,急性期,症状典型或用药之前采集标本.2）根据不同目的采用不同的采集方法.3）除痰,大便,肛拭子等体外标本,其他标本采集时应用无菌操作,采集量不得过少.4）最好床边接种.(保温,冷藏,厌氧或种入运送培养基内).5)采集运送时必须注意安全,防止污染及交叉感染.122019/8/13（二）微生物学检查接到标本后立即进行微生物学检查.1.直接镜检：标本经涂片染色或制备湿片镜检。2.快速诊断：快速检测病原体成分主要是指特异性抗原和核酸检测.特异性抗原检测包括免疫荧光技术,胶乳凝集试验,酶免疫技术,对流免疫电泳,化学发光免疫测定等.3.直接药敏试验：直接将标本接种于平板，用抗生素纸片作药物敏感试验，在18—24h内可获得结果。4.常规检验：1)分离培养：通常由正常无菌部位采取的标本接种血平板，置空气或5%—10%二氧化碳的气缸中培养，大部分细菌可于24—48h生长良好。2)鉴定：分离出的细菌一般经过细菌形态,菌落特点,生化反应,血清学试验,动物接种等鉴定。132019/8/133)体外纯菌药物敏感性试验:包括抑菌试验,杀菌试验,联合药敏试验和检测细菌产生的抗生素灭活酶等。4)报告:直接镜检要求2小时报告,说明标本合格,发现微生物情况和特点;初步鉴定和直接药敏结果于24小时或次晨报告,报告可能的病原菌和直接药敏结果;最后鉴定和细菌药敏结果一般不超过3天。5.血清学诊断:是指用已知抗原或已知抗体检测患者血清中相应抗体或抗原的方法。血清学凝集试验：采用含有已知特异性抗体的血清与分离培养出的未知纯种细菌或标本种的抗原进行血清学反应,以确定病原菌的种或型。142019/8/13临床微生物实验室安全措施和质量保证1.感染性废弃物的处理1)去污染,任何污染材料未经消毒不能拿出实验室.2)液体废弃物必须收集在防漏,未破的容器内,经高浓度的化学消毒剂处理.3)对剩余的标本,接种过的培养基,菌种等丢弃前均须消毒.4)对于任何有污染的锐器如针头,注射器,玻片等在处理前不要用手接触.152019/8/132.微生物实验室的室内质控1)对细菌检验人员的要求;2)操作手册;3)仪器设备的功能监测;4)培养基的质量控制;5)试剂,染色液以及抗血清的质量控制;6)标本检验的质量控制;7)标准菌株的来源和保存及室内质量的全面控制.微生物检验的室间质评162019/8/131.微生物检查基本方法与诊断技术。2.微生物学检验概述。172019/8/13二、临床常见的微生物及检验方法(例）182019/8/13一、球菌葡萄球菌(一)生物学特性1.形态与结构：本菌属G染色阳性,呈圆球形,不规则成堆排列,形似葡萄串状,无荚膜.无鞭毛和芽孢.2.培养特性：需氧或兼性厌氧,营养要求不高.最适PH为7.4,经37℃24—48h培养,可形成圆形,凸起,表面光滑湿润,边缘整齐不透明的菌落,可产生不同的脂溶性色素,如白色,金黄色,柠檬色色素。在血平板上,几乎所有的葡萄球菌可产生α,β,γ和δ溶血在液体培养基中生长迅速生长呈均匀混浊状.192019/8/133)分类方法：根据其在固体培养基上产生的不同色素分为金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌和柠檬色葡萄球菌。1965年,国际葡萄球菌和微球菌分类委员会将葡萄球菌分为凝固酶阳性和阴性葡萄（CNS）。CNS包括表葡、腐生葡萄球菌。凝固酶阳性葡萄球菌包括金葡、中间型和家畜葡萄球菌。(二)微生物检查1.标本采集:脓汁,渗出液,分泌物,血,尿,粪便,痰液及脑脊液。2.检查方法及鉴定202019/8/131)直接镜检涂片,G染色镜检,如为阳性球菌呈葡萄状排列可初诊.初报为找到G阳性葡萄状排列球菌,疑为葡萄球菌。2)分离培养脓汁,尿液.脑脊液等离心沉淀,可直接接种血平板。37℃18—24h培养可产生不同色素的菌落.金黄色葡萄球菌在周围有透明溶血环.3)鉴定试验a.触酶试验：细菌产生的过氧化氢酶催化双氧水生成水和氧气,产生气泡.b.血浆凝固酶试验：血浆凝固酶是金黄色葡萄球菌所产生的一种与其致病力有关的侵袭性酶,分游离型和结合型。其作用是血浆中的纤维蛋白在菌体表面沉积和凝固以阻碍吞噬细胞的吞噬。212019/8/13c.甘露醇发酵试验d.新生霉素敏感试验凝固酶阴性的葡萄球菌：敏感为表皮葡萄球菌;耐药为腐生葡萄球菌。e.同时进行体外药物敏感试验本唑西林：MSS/MRSβ-内酰胺酶万古酶素的敏感性。金黄色葡萄球菌:触酶+凝固酶+甘露醇+新生酶素S表皮葡萄球菌:+-+S腐生葡萄球菌:+-+R报告:检出XXX葡萄球菌222019/8/134)耐药性检测:耐甲氧西林金葡菌（MRSA），耐甲氧西林的表葡菌（MRSE）。5)临床意义：葡萄球菌感染的特点是感染部位组织的化脓，坏死和脓肿形成。金葡，表葡和腐生葡萄球菌是引起临床感染最常见的葡萄球菌。①金葡菌引起疖，痈，外科伤口，创伤的局部化脓性感染，入血后可引起深部组织的化脓性感染。其产生的肠毒素可引起食物中毒，表现为急性胃肠炎。主要致病物质有血浆凝固酶，葡萄球菌溶血素，杀WBC素，肠毒素，表皮溶解毒素和毒性休克综合症毒素②表葡是存在于皮肤的正常菌群，由于各种导管植入和人造组织的使用，该菌已成为医院感染的重要病原菌，是导致血培养污染的常见菌之一。③腐生葡萄球菌是导致尿路感染的常见菌之一。232019/8/13四、医院感染与抗菌药物敏感性试验242019/8/13一、医院获得性感染(hospitalacquiredinfection)：包括医院内各种人群所获得的感染。对象——一切在医院内活动的人群（主要为住院病人）地点——感染发生必须在医院内时间——病人在住院期间或出院后不久发生的感染，及与前次住院有关的感染。一、医院感染252019/8/13医院感染的类型按微生物来源•内源性医院感染——由自身正常菌群转变成机会性致病菌所致特定条件——寄居部位改变——免疫功能下降——菌群失调•外源性医院感染（交叉感染）——患者遭受医院内非自身存在的病原体侵袭而发生的感染。病人之间、医患之间、污染医护用品或诊治设备、环境空气等，也称医院内感染。按感染部位分类——全身各部位均可发生262019/8/13易感宿主：主要是原发病引起机体抵抗力低下，接受影响免疫功能的药物治疗或接受侵袭性操作措施的病人。这些病人主要表现为局部或全身免疫功能受损，正常菌群被破坏，抑制外部细菌定植能力减弱或消失，使病人处于高度易感状态。医院感染常见的微生物主要是机会性致病菌（常为内源性感染）常为耐药菌;新的病原菌不断出现;主要是细菌，其次为病毒和真菌。常见的微生物有：1．细菌葡萄球菌属、微球菌属、链球菌属、肠杆菌科、假单胞菌属、不动杆菌属、军团菌、脑膜炎败血性黄杆菌、结核杆菌、李斯特菌、类杆菌、产气荚膜梭菌、破伤风杆菌、核梭杆菌、丙酸杆菌、消化球菌等。272019/8/132．真菌念珠菌、组织胞浆菌、球孢子菌、隐球菌、曲霉菌等。3．病毒肝炎病毒、水痘病毒、流感病毒、轮状病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒等。4．对于机体的不同系统，医院感染的病原菌也不同，目前G阴性杆菌仍占主要地位，凝固酶阴性葡萄球菌及肠球菌感染率逐渐上升，尤其应该注意的是MRSA及耐万古霉素肠球菌引起的医院感染。282019/8/13二、监控抗感染治疗的实验室方法(一)抗菌药物选择原则：合理使用抗生素，应根据病原学及其药敏试验结果，结合抗生素的性能，药理学情况及患者生理、病理、免疫状态合理选用抗生素。(二)抑菌试验原理及方法目前常用的方法是纸片琼脂扩散法，是一种半定量的方法。美国CLSI(NCCLS)纸片扩散法敏感试验分委会所推荐的标准方法是K—B法，此法是目前公认的标准实验方法。292019/8/13纸片琼脂扩散法原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后会不断地向纸片周围区扩散，形成递减的剃度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反应检测菌对测定药物的敏感程度，并与该菌对待检菌的最低抑菌浓度呈负相关。试验方法在纯培养平板上挑取相同的菌落4-5个。用无菌生理盐水调菌液为0.5麦氏单位（约含菌１Ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ），在15min内接种完。302019/8/13用无菌棉试蘸取菌液，在试管壁上挤压几次，压去多余的菌液，分三个方向即每次旋转平板60°,使整个MH平板涂布均匀.涂布菌液的平板于室温中干燥3-5min后,用纸片分配器或无菌镊子取药敏纸片,贴于平板表面,并用镊尖轻压一下纸片,使其贴平.每张纸片的间距不小于24mm,纸片的中心距平板的边缘不小于15mm,90mm直径的平板宜贴6张药敏纸片.将贴好纸片的平板置35℃孵育18-24h后,用标尺量取抑菌圈直径.结果判断根据量取抑菌圈的直径（包含纸片的直径），以毫米数报告（取整数）。(不同