微生物的遗传变异与菌种选育

第六章微生物的遗传变异与菌种选育在应用微生物加工制造和发酵生产各种食品的过程中，要想有效地大幅度提高产品的产量、质量和花色品种,首先必须选育优良的生产菌种，才能达到目的。而优良菌种的选育是在微生物遗传变异的基础上进行的。遗传和变异是相互关联，同时又相互矛盾对立的两个方面，在一定条件下，二者是相互转化的。认识和掌握微生物遗传变异的规律是搞好菌种选育和关键。本章主要内容微生物遗传变异的基本原理☀关于微生物遗传变异的物质基础及其存在形式。☀关于微生物基因突变的基本原理（类型、特点和机制）。☀关于微生物基因重组的基本原理（方式和特点）。微生物菌种的选育☀关于野生型微生物菌菌株分离、筛选与纯化。☀关于微生物的诱变育种的工作程序和方法步骤。☀关于营养缺陷型突变菌株的筛选方法和具体应用。☀原生质体融合育种技术的操作程序。☀基因工程育种技术的操作步骤和取得的成就。☀微生物菌种退化的原因；掌握菌种复壮的方法、防止菌种退化的措施以及菌种保藏的方式和原理。第一节微生物遗传变异的物质基础证明核酸是遗传变异物质基础的经典实验肺炎双球菌的转化实验噬菌体的感染实验烟草花叶病毒的拆开与重组实验肺炎双球菌的转化实验注射R型活菌小鼠不发病（存活）注射S型灭活菌小鼠不发病（存活）注射S型活菌小鼠发病死亡注射R型活菌+S型死菌小鼠发病死亡心血分离到S型活菌⑴动物试验热致死S型菌培养皿培养无菌落生长R型活菌培养皿培养培养出R型菌落热致死S型菌+R型活菌培养皿培养培养出大量R型和S型菌落R型活菌+S菌抽取提物培养皿培养培养出大量R型和S型菌落⑵细菌培养试验噬菌体的感染实验1952年侯喜(A.Hershey)和蔡斯(M.Chase)利用示踪元素，对大肠杆菌T2噬菌体进行了这类实验。先用含有35S和32P两种元素的培养基培养大肠杆菌，然后让T2噬菌体侵染培养后的大肠杆菌，从而使T2噬菌体打上35S和32P的标记。让这种T2噬菌体侵染不含标记元素的大肠杆菌，并在T2噬菌体完成了吸附和侵入后，强烈搅拌洗涤，以便使吸附在菌体外表的T2噬菌体蛋白质外壳脱离细胞并均匀分布，再进行离心沉淀，分别测定沉淀物和上清液中的同位素标记。结果发现，几乎全部35S都在上清液中，而几乎全部32P和细菌一起出现在沉淀物中。烟草花叶病毒的拆开与重组实验1956年，美国的法朗克-康勒特(Fraenkel-Conrat)将烟草花叶病毒拆成RNA(因该病毒不含DNA)和蛋白质，并分别对烟草进行感染实验；结果发现只有RNA能感染烟草，并在感染后的寄主中分离到完整的具蛋白质外壳的烟草花叶病毒。后来他又将甲、乙两种变种的烟草花叶病毒拆开，在体外分别将甲病毒的RNA和乙病毒的蛋白质结合，将乙病毒的RNA和甲病毒的蛋白质结合进行重组。接着他把这些经过重组的病毒分别感染烟草。结果从寄主分离所得的病毒蛋白质均取决于相应病毒的RNA。证明了核酸(RNA)是烟草花叶病毒的遗传物质基础。二、遗传物质在细胞中的存在方式（一）细胞水平从细胞水平来看，细胞核；除此之外，在细胞质中存在着一些能自我复制的遗传物质，一般称这部分DNA为质粒。（二）亚细胞核水平真核微生物的细胞核有核膜包围，形成具有完整形态、在光学显微镜下清晰可见的细胞核，核内DNA与组蛋白结合在一起构成染色体。（三）分子水平DNA（RNA）－－→在DNA大分子上存在着决定某些遗传性状的特定区段，即所谓基因－－→一个基因含若干核苷酸碱基组成的三联密。四种核苷酸，按其排列组合方式的不同，可编出三联密码43＝64个，用于决定组成蛋白质的20种氨基酸顺序。起始密码（AUG）和终止密码（UAA、UGA和UAG）。第二节微生物的基因突变一、基因突变的类型基因突变的类型是多种多样的，按突变体表型不同，可分为以下几种类型：（1）形态突变型。（2）条件致死突变型。（3）营养缺陷突变型。（4）抗性突变型。（5）抗原突变型。（6）其他突变型。二、基因突变的特点整个生物界，由于它们遗传变异的物质基础是相同的，因此显示在遗传变异的本质上都具有相同的规律，这在基因突变的水平上尤其突出。（1）不对应性。（2）自发性。（3）稀有性。（4）独立性。（5）诱变性。（6）稳定性。（7）可逆性。三、基因突变的机理（一）诱发突变及其机理1碱基对的置换⑴直接引起置换的诱变剂（亚硝酸类、烷化剂类）⑵间接引起置换的诱变剂（碱基类似物）2移码突变3染色体畸变（二）自发突变的机制1背景辐射和环境中多因素低剂量的诱变效应2微生物自身代谢产物的诱变效应3互变异构效应4环状突出效应碱基对的置换碱基对的置换可分成两个亚类：一类是DNA链上的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换，称为转换；另一类是DNA链上的一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换，称为颠换A：TT：AATC：GG：CCG双链DNA单链DNA（实线代表转换，虚线代表颠换）直接引起置换的诱变剂亚硝酸是一种对含有氨基的碱基对直接作用而诱发碱基对转换的诱变剂。它能使碱基中的氨基氧化脱氨，从而使腺嘌呤（A）变成次黄膘呤（H），胞嘧啶（C）变成尿嘧啶（U），而后由于H和C配对，U与A配对，因此当DNA再次复制时，A:T就转换为G:C，而G:C就转换为A:T。H:C↗H:C-→G:C↗H:C→G:C↗A:T→H:T-----→A:T亚硝酸类引起的碱基对置换O:AT:A（颠换）O:CG:C（复原）G:CRG:CO:CO:TA:T（转换）O:GC:G（颠换）烷化剂是诱变育种极其重要的一类诱变剂，它们的化学结构都带有一个或多个活性烷基。所有这些物质通过烷化磷酸基形成烷化嘌呤和烷化嘧啶与DNA作用，特别是经常形成烷化鸟嘌呤。烷化作用导致基因突变的机制尚未定论。①碱基类似物作用，引起碱基配对的错误。②烷基在鸟嘌呤引起脱嘌呤作用，使鸟嘌呤从DNA链上脱落下来，进而引起DNA复制时碱基对的缺失和置换。。间接引起置换的诱变剂A:BU/G:BrU↗G:BrU--→G:C5-BU↗A:T-－→A:BU------→A:T(a)G:BrU/A:BU↗A:BU----→A:T5-BrU↗G:C----→G:BrU------→G:C(b)5-溴尿嘧啶的诱变效应a.5-BU以酮式掺入；b.5-BrU以烯醇式掺入5-氨基尿嘧啶（5-AU）、8-氮鸟嘌呤（8-NG）、α-氨基嘌呤（α-AP）及6-氮嘌呤（6-NP）等。它们的作用是通过活细胞的代谢活动掺入到DNA分子中后，引起碱基对的置换，因此是间接的。在这些碱基类似物中，最常被应用的是5-溴尿嘧啶（5-BrU）和α-氨基嘌呤（α-AP）。5-BrU是T的代谢类似物。5-BrU以酮式状态时可以替代T，与A配对；5-BrU以烯醇式状态时替代C与G配对；5－BrU可以通过烯醇式和酮式结构的变化；引起碱基对置换。移码突变移码突变这是指由一种诱变剂而引起DNA分子中的一个或少数几个碱基插入或缺失，从而使该部位后面全部遗传密码发生转录错误的一类突变。吖啶类染料及其化合物是移码突变的有效诱变剂，例如三氨基吖啶，吖啶黄，吖啶橙，5-氨基吖啶。吖啶类化合物的诱变机制目前还不很清楚。现普遍认为，由于吖啶类化合物是一种平面型三环分子结构，与一个嘌呤:嘧啶碱基对相似，因此能够嵌入两个相邻的DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开，从而在DNA复制过程中，会使链上插入或缺失一个碱基，结果引起移码突变。染色体畸变染色体畸变是指由诱变剂引起DNA分子的大损伤，它包括染色体结构上的缺失、重复、易位及倒位等。紫外线、X射线、γ射线等射线及亚硝酸、烷化剂等均能引起染色体畸变，尤其是紫外线能引起DNA分子多处较大的损伤。紫外线主要通过在同链DNA相邻的嘧啶间或在互补双链间形成以共价键结合的胸腺嘧啶二聚体，微生物能以多种方式去修复被紫外线损作后的DNA，主要方式有两种：（1）光复活作用。由于微生物中一般都存在着光复合作用，因此，用紫外线照射菌液时都须在红光下进行操作处理微生物，而后在暗室或用黑布包起来培养。（2）暗修复作用。也称切除修复作用。X射线和射线为电离辐射，含有很高的能量，能产生电离作用，因而能直接或间接地改变DNA结构。直接的效应是碱基的化学键，脱氧核糖的化学键和糖—酸相连接的化学键断裂；第三节微生物的基因重组基因重组又称为遗传重组，它是指把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子的重新组合后，形成新遗传型个体的过程。重组是分子水平上的概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交，而一般所说的杂交是细胞水平上的概念。杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交一种形式。真核微生物中的有性杂交，准性生殖以及原核微生物中的转化、转导、接合和溶原转变等都是基因重组在细胞水平上的反映。一、原核微生物的基因重组（一）转化（transtormation）受体菌直接吸收来自供体菌的DNA片段，通过交换组合把它整合到自己的基因组中，从而获得了供体菌的部分遗传性状的现象，称为转化。转化后的受体菌，称为转化子。供体菌的DNA片段称为转化因子。只有处于感受态的细菌才能接受转化因子，进行转化作用。转化过程大致是这样的：①从供体菌提取出转化因子双链DNA片段；②双链DNA片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合；③在结合位点上，双链DNA中的一条单链逐步降解，同时另一条链逐步进入受体细胞。④进入受体细胞的DNA单链与受体菌染色体组上同源区段配对，而受体菌染色体组的相应单链片段被切除，并被进入受体细胞的DNA单链所取代，于是形成了杂种DNA区段；⑤受体菌染色体进行复制，其中杂种区段被分离成两个，一个恢复，一个形成一个转化子。一、原核微生物的基因重组（二）转导（transduction）通过缺陷型噬菌体或温和型噬菌体为媒介，将供体细菌细胞中DNA片段携带到受体细菌细胞中，从而使受体细菌获得供体细菌的某些遗传性状的现象，称为转导。根据媒介噬菌体的不同，转导分普遍性转导和局限性转导两类。1．普遍性转导由缺陷型噬菌体误包（而非整合）供体细菌DNA中的任何一部分片段（包括核外遗传物质在内）后，当它再次感染受体细菌时，使后者获得了这部分遗传性状的现象，称为普遍性转导。它的转导频率为105～108。2．局限性转导由温和噬菌体侵染而形成的某一溶源细菌群被诱导裂解时，其中极少数个体的DNA可能与噬菌体DNA发生若干特定基因的交换，从而被整合到噬菌体的基因组上，当该噬菌体再次感染受体细菌时，就使受体细菌获得了这一特定遗传性状的现象，称为局限性转导，它的转导频率为10-6。一、原核微生物的基因重组（三）接合（conjugation）通过供体细菌和受体细菌完整细胞间的直接接触而传递大段DNA的过程，称为接合（有时也称杂交）。在细菌中，接合现象研究最清楚的是大肠杆菌。发现能够进行接合现象的大肠杆菌有雄性与雌性之分，而决定它们性别的是由是否存在F因子所决定。F因子又称致育因子，是一种质粒，分子量为5×107道尔顿；雌性细菌不含F因子，称为F-菌株，雄性细菌含有游离存在的F因子，称为F+菌株，当雄性细菌细胞中所含的F因子被整合在细胞核的DNA上，不呈游离状态存在称为Hfr菌株（高频重组菌株）；有时被整合在细胞核DNA上的F因子，从DNA上面脱落下来，呈游离存在，但在脱落时，F因子有时能带一小段细胞核DNA。我们将这种含有游离存在的但又带有一小段细胞核DNA的F因子的细菌称为F′菌株。•接合的基本过程•滚环复制模型接合的结果：F++F-2F+F′+F-2F′Hfr+F-多种情况Hfr+F-Hfr＋F-（多数情况下）Hfr+F-Hfr＋Hfr（少数情况下）一、原核微生物的基因重组（四）溶源性转变宿主菌在感染温和噬菌体后，由于噬菌体DNA整合到核DNA后，导致宿主菌某些新的遗传性状表达，即所谓溶源性转变。这是一种与转导相似但又有本质不同的现象。溶源转变与转导在本质上的不同，首先是它的温和噬菌体不携带有任何供体菌的基因，其次这种噬菌体是正常的完整的，而不是异常情况下产生