微生物研究进展chapter5 分子生态学方法在环境微生物研究领域的应用

第五章分子生态学方法在环境微生物研究领域的应用农学系生物技术专业课程《微生物学研究进展》一、微生物分子生态学的理论二、微生物分子生态学的研究方法三、展望墨西哥湾“深海地平线”钻油台2010年4月20日爆炸起火沉没后不断漏油。钻油台所属的英国石油公司近日宣布又发现一处泄漏点，令漏油量多达每日5000桶，是原先估计的5倍，并正逼近美南部4个州的海岸。1、传统培养法的瓶颈微生物多样性被用于监视和预测环境变化,也是新基因资源的重要来源。传统纯培养技术虽然已经帮助人们认识了很多微生物，创造了巨大的财富，但是由于什么原因？各种环境中能纯培养的微生物种类非常有限，远远不能反映出自然界微生物多样性的丰度和范围。一、微生物分子生态学的理论2、微生物分子生态学的产生为了突破传统纯培养方法的限制，必须要有一种能绕过纯培养这一步的新技术，来推动微生物多样性的研究。微生物分子生态学的产生使得微生物群落的研究由细胞水平深入到分子机制研究水平,提出了微生物分子进化和分子适应等全新概念,使微生物生态学理论更加接近自然本质。3、微生物分子生态学的概念利用分子生物学技术手段研究自然界微生物与生物及非生物环境之间相互关系及其相互作用规律的科学。主要研究微生物区系组成、结构、功能、适应性发展及其分子机制等微生物生态学基础理论问题。墨西哥湾“深海地平线”钻油台2010年4月20日爆炸起火沉没后不断漏油。钻油台所属的英国石油公司近日宣布又发现一处泄漏点，令漏油量多达每日5000桶，是原先估计的5倍，并正逼近美南部4个州的海岸。环境微生物群落微生物代谢生理学方法生物化学方法分子生物学方法呼吸醌指纹法脂肪酸指纹法PLFABIOLOG法杂交法基于16SrDNA方法宏基因组核酸探针杂交荧光原位杂交FISH16SrDNA克隆文库DGGE/TGGESSCPT-RFLP、ARDRARFLP、RISARADP、ERIC等基因芯片技术二、微生物分子生态学的研究方法1、研究路线分析方法方法类别原理优点缺点分子杂交核酸探针杂交DNA的变性、复性及其在复性过程中的碱基配对原则、探针与靶分子的特异性结合过程简单避免PCR偏差影响杂交分析结果的因素复杂，只能用来检测事先已知其目标基因序列的微生物FISH人工合成的荧光或放射性标记探针与微生物基因组杂交操作简单，可原位检测，检测灵敏度高只能对特定类群的微生物进行研究其它分子生物学方法RFLP序列差异引起限制性内切酶酶切位点的差异信息量大重复性高周期长，过程繁琐RAPD利用随意设计的非特异引物简单、迅速重复性低ERIC肠杆菌基因间重复共有序列在不同种属或者同属的不同种微生物之间的拷贝数和定位的差异引起两个ERIC之间序列的多态性结果稳定重复性好灵敏度高PCR反应本身的扩增和偏差可能会产生假阳性，不能对群落中感兴趣的菌进一步研究分析方法方法类别原理优点缺点基于16SrDNA的方法16SrDNA克隆文库可以用来揭示不同物种的系统进化关系反映各种微生物种类构成和亲缘关系工作量大，成本高，不能对目标种群进行原位和实时的检测DGGE不同的变性剂浓度，解链之后电泳速度将会急剧下降DNA片段纯化后可以直接用于测序分辨率低，被分析的片段不能大于400bpTGGE温度梯度，利用不同序列结构的DNA，双链具有不同的熔点温度Tm同上同上SSCP长度相同但序列不同的单链DNA具有空间构象上的差异操作比较简便价格低廉灵敏度和重现度差，150～400bp最佳的分离效果ARDRA16SrDNA序列的差异，限制性核酸内切酶酶切后将得到长度与数量不同的DNA片段分辨率高对图谱进行定量化解析和进行群落间的比较都十分困难T-RFLPPCR扩增中所用引物的一端或两端带有荧光标记方便快捷分辨率高灵敏度高复杂群落多样性的低估、影响因素多、无法对微生物定性分析RISA核糖体区间序列多态性操作简单、序列多态性丰富核糖体的拷贝数的不同会产生假阳性2、荧光原位杂交（FISH）利用生物素或地高辛等非放射性物质标记探针，并通过荧光直接标记或者荧光素偶联的抗原-抗体检测系统，对DNA或RNA进行定性或定位分析。2、基于16SrDNA的指纹图谱法为什么选择16SrRNA基因作为微生物进化的遗传标记?方法：•16SrDNA克隆文库/ARDRA•DGGE/TGGE•RFLP/T-RFLP•RISA（ITS）•SSCP⑴构建16SrDNA克隆文库环境样品提基因组扩增混合基因组16SrDNA与载体连接，转入感受态细胞微生物群落结构信息挑取单克隆鉴定是否为阳性克隆酶切、PCR方法鉴定全部阳性克隆测序与数据库序列比对系统发育分析阳性克隆鉴定PCR扩增所有16SrDNA片段两种或两种以上四碱基限制性内切酶酶切内切酶图谱分型每种类型挑选1-3个克隆测序序列比对及分析由于载体与DNA片段一一对应，可得到单个DNA片段重组质粒，转化时过程中绝大多数感受态细胞只能接受一个外源DNA分子，由此便可达到把混合片段分开的目的ARDRA•优点得到的序列信息比较完整片段携带的信息量大，结果可靠适合对环境中微生物群落的整体结构进行分析•缺点工作量大不能对目标种群进行原位和实时监测VinhD.Pham等人用16SrDNA文库结合fosmid方法研究了阿拉斯加某中温油藏采出水中细菌和古细菌的多样性，结果表明古细菌和细菌数量均等，未培养微生物约占检出总量的30%左右，检测到的古细菌主要是乙酸型产甲烷古菌。佘跃惠等人也用16SrDNA文库结合TGGE方法研究了大港孔店油田注水油藏微生物群落的多样性，结果表明注水井中的微生物多样性比采油井中丰富，注水井样品中的细菌主要属于变形菌门和放线菌纲,尤其是红细菌亚纲(47%)。采油井样品的细菌主要属于变形菌门,尤其是假单胞菌属(62%)。通常采用构建16SrDNA文库方法与其它分子生物学方法联合，对环境微生物群落结构进行分析。16SrDNA克隆文库数据分析根据不同的酶切图谱分型后，可以得到该环境样品中的微生物组成信息。同时，根据每一个OTU所含的克隆数目，也可以推测出该环境中的优势菌群。OTUsMatch_NameclonenumbertheratioofallclonesgenusOTU1MethanosaetathermophilaPT3427.42%甲烷鬃菌属OTU2Methanolineatarda43.23%甲烷绳菌属OTU3Unculturedarchaeon10.81%未培养古菌OTU4Unculturedarchaeon10.81%未培养古菌OTU5Unculturedarchaeon54.03%未培养古菌OTU6Unculturedarchaeon75.65%未培养古菌OTU7Unculturedarchaeon118.87%未培养古菌OTU8Unculturedarchaeon10.81%未培养古菌OTU9Unculturedeuryarchaeote10.81%未培养牛瘤胃古菌OTU10UnculturedMethanosarcinales5241.94%甲烷八叠球菌属OTU11Unculturedeuryarchaeoteclone10.81%未培养牛瘤胃古菌OTU12Unculturedcrenarchaeote21.61%泉古菌门OTU13UnculturedMethanosaetasp.10.81%甲烷鬃菌属OTU14Unculturedarchaeon21.61%未培养古菌OTU15Unculturedarchaeon10.81%未培养古菌以大庆油田采出水样品古菌文库为例：⑵变性梯度凝胶电泳DGGE产生：1979年由Fisher和Lerman最先提出的用于检测DNA片段中的点突变的一种电泳技术原理：碱基组成不同DNA序列，其解链温度也各不相同。由此，便可通过设定不同的变性条件（变性剂浓度或者温度）将不同的DNA片段分开。特点：分离大小相同，但碱基组成不同的序列16SrDNA的高可变区E.coli16SrRNA二级结构及各可变区•V3区约170bp•V6-V8区约350bp•片段大小不同，携带的信息量不同，选择不同的区域得到DGGE图谱不同，群落信息也有差异•不同的片段大小对应的胶浓度也不同•根据需要选择最合适的•提取基因组后，扩增16SrDNA高可变区片段确定合适的变性剂范围对DNA片段进行有效分离根据变性剂梯度方向与电泳方向相同或不同,DGGE分为：垂直DGGE平行DGGEGC-Clamp调节目的序列的解链行为，为一段40bp的高GC含量的片段常规的DGGE电泳技术对于长度超过500bp的DNA片段的序列变化情况,只能有50%的检出率。应用“GC夹板”技术可使检出率提高到100%。当等长的双链DNA分子在含梯度变性剂(尿素、甲酰胺)聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时,因其解链的速度和程度与其序列密切相关;部分解链的DNA分子的迁移速度随解链程度增大而减小。GC-Clamp16SrDNA低浓度高浓度DGGE的参数：•胶浓度取决于片段大小，通常不宜超过500bp6%胶浓度：400～1000bp8%胶浓度：200～400bp10%胶浓度：100～300bp•变性剂范围不同的样品不同•温度一般都用60摄氏度•电压•时间环境样品分析的流程DGGE在微生物分子生态学中的应用•对微生物群落结构进行对比、分析或者跟踪监测。•通过扩增功能基因来研究功能基因及功能菌群的多样性。•跟踪及检测细菌的富集和分离，评价不同的培养条件对分离菌种的影响。举例：油藏古细菌V3区DGGE图谱胶浓度：10%变性剂范围：40%-60%电压：200V运行时间：4.5h优点：缺点：•分辨率有限，复杂环境中（土壤或肠道），只能检测出优势菌。•一般只能分析500bp以下的片段。•PCR过程产生的异源双链和单链DNA会对分析造成偏差。RFLP（限制性片段长度多态性）探针：限制性内切酶：HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ、EcoRV、XbaⅠ等。优点遍布整个基因组，数据多态信息量大结果非常稳定，重复性好，探针多缺点技术复杂，周期长，费用高检测中需放射性物质，限制了广泛应用DNA量大，分析速度慢T-RFLP（末端限制性片段长度多态性）•每个荧光峰至少代表一个细菌或几个近缘的细菌•每个峰面积占总峰面积的百分数代表这个末端限制性片段的相对数量，可粗略认为与细菌在某一部位的微生态群落中的相对数量T-RFLP的优点：相对于其它方法，T-RFLP技术分析更为迅速，且结果可以数据的形式输出，因而在微生物群落的快速检测和分析中更有优势。分析方法方法类别原理优点缺点基于16SrDNA的方法16SrDNA克隆文库可以用来揭示不同物种的系统进化关系反映各种微生物种类构成和亲缘关系工作量大，成本高，不能对目标种群进行原位和实时的检测DGGE不同的变性剂浓度，解链之后电泳速度将会急剧下降DNA片段纯化后可以直接用于测序分辨率低，被分析的片段不能大于400bpTGGE温度梯度，利用不同序列结构的DNA，双链具有不同的熔点温度Tm同上同上SSCP长度相同但序列不同的单链DNA具有空间构象上的差异操作比较简便价格低廉灵敏度和重现度差，150～400bp最佳的分离效果ARDRA16SrDNA序列的差异，限制性核酸内切酶酶切后将得到长度与数量不同的DNA片段分辨率高对图谱进行定量化解析和进行群落间的比较都十分困难T-RFLPPCR扩增中所用引物的一端或两端带有荧光标记方便快捷分辨率高灵敏度高复杂群落多样性的低估、影响因素多、无法对微生物定性分析RISA核糖体区间序列多态性操作简单、序列多态性丰富核糖体的拷贝数的不同会产生假阳性分析方法方法类别原理优点缺点分子杂交核酸探针杂交DNA的变性、复性及其在复性过程中的碱基配对原则、探针与靶分子的特异性结合过程简单避免PCR偏差影响杂交分析结果的因素复杂，只能用来检测事先已知其目标基因序列的微生物FISH人工合成的荧光或放射性标记探针与微生物基因组杂交操作简单，可原位检测，检测灵敏度高只能对特定类群的微生物进行研究其它分子生物学方法RFLP序列差异引起限制性内切酶酶切位点的差异信息量大重复性高周期长，过程繁琐RAPD