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1第七章微生物的生长及其控制第一节微生物生长规律第二节影响微生物生长的环境因素第三节微生物生长的控制方法2第一节微生物的生长规律7.1.1微生物的培养和群体生长7.1.2生物量测定方法7.1.3微生物的生长规律7.1.4生长参数和生长过程控制7.1.5维持稳定生长的方法3微生物的培养：在实验室或在工业上，使用培养基和培养容器，在特定培养工艺和培养条件下，人工培养微生物，获得微生物菌体或代谢产物的过程；在培养过程中，微生物的个体生长表现为细胞组分的均衡增加，细胞形态略有增大；微生物的繁殖导致个体数量或生物量有规律的增长，表现为群体的生长；群体生长与培养条件（培养基和环境因素）密切相关；7.1.1微生物培养和群体生长4在人工培养条件下培养微生物，通过繁殖而得到的微生物群体称为培养物（culture）；只有一种微生物的培养物，或者由单个细胞繁殖得到的微生物群体，称为纯培养物（pureculture），简称纯培养；微生物的实验室培养和工业发酵，一般都是纯培养；微生物由于个体微小，很容易混杂，需要经常性的进行菌种纯化，以获得微生物的纯培养；微生物的纯培养5平板单菌落分离法：使微生物的单细胞或单孢子充分分散，彼此分开，然后涂布在固体平面培养基上，培养后长出的单菌落，很可能是由一个细胞或孢子繁殖形成的纯培养；平板划线法分离法稀释涂（倒）平板法显微操纵器分离：借助显微镜和显微操作工具，直接分离单细胞（单孢子），然后接种培养；纯培养的分离方法6用接种环取一环菌悬液或菌苔，在平板上划线；每画一组平行线，灼烧接种环一次；反复划线、可拉出单细胞；平板划线法分离法7稀释涂（倒）平板法将待分离材料制备成悬液，使细胞或孢子充分分散；用10倍稀释法稀释，取适当浓度的稀释液，涂布平板或与培养基混合后倒平板：涂平板加菌悬液0.2mL倒平板加菌悬液1mL8微生物的培养方法根据培养基物理状态和培养规模，好氧微生物培养方式分为：固体斜面培养、固体平板培养、茄子瓶培养、大规模固体发酵；半固体试管培养；摇管培养、摇瓶培养、小型发酵罐培养、大规模深层搅拌液体发酵；实验室培养厌氧菌需要驱除和隔绝氧气；工业厌氧液体发酵；9在微生物生理代谢基础研究，或者微生物工程应用中，大多使用发酵罐（生物反应器）进行液体培养；分批培养（batchculture）：指恒定体积的液体培养，从接种开始，直到培养结束，在培养过程中不补充营养，也不移出培养物；流加分批培养：在培养过程中，不断流加营养物，培养体积不断增加；连续培养：在培养过程中，不断流加营养物，同时不断移出培养物；发酵罐微生物液体培养方式10微生物工业发酵过程发酵工程包含三个过程：上游技术（微生物遗传育种技术）、微生物发酵过程和下游技术（分离工程）；微生物发酵过程包含同时进行的微生物培养过程和微生物反应过程；在工业微生物发酵过程中，既要控制微生物的生长，又要控制微生物的代谢；通常的微生物培养仅需要控制微生物的生长；控制微生物生长，必需了解微生物的生长规律，清楚影响生长的主要因素；11青霉素G的发酵生产工艺——发酵（反应）过程种子培养：产生健壮和大量的种子；产黄青霉接种到固体培养基上，在25℃下培养7天，收获产黄青霉的孢子；将孢子洗脱下来，制备孢子悬液，接种到液体种子培养基中，在27℃下，种子罐通气搅拌培养24h；发酵培养（微生物反应）：获得大量次级代谢产物；将种子培养液接种到发酵罐中，在27℃下，通气搅拌培养7天，期间流加苯乙酸，作为合成青霉素的前体物；12种子扩大培养和发酵的工艺流程和工艺条件工业发酵：通过控制微生物的培养条件，使微生物正常生长，并大量积累目标代谢产物；平面培养一级种子罐培养摇管培养摇瓶培养二级种子罐培养发酵培养137.1.2生物量测定方法微生物培养物的定量测定，称为生物量测定；测定对象不同，方法不同，单位也不同，但可互相校正；显微镜直接计数法：测单细胞或单孢子；平板菌落计数法：测单细胞或单孢子；细胞湿重和干重法：测定单细胞或丝状微生物；分光光度法：测单细胞或单孢子；生理指标法：测定单细胞或丝状微生物；14显微镜直接计数法显微镜直接计数法：是在显微镜下，用血球计数板对单细胞或单孢子直接计数，单位为：个数/mL；显微镜直接计数法不能区分死菌与活菌，称为全菌计数法；15血球计数板是一块特殊的载波片，在中间的两个平台上各刻有一个大方格网；大方格网由九个大方格组成，中间的正方形大方格为计数室；计数室边长1mm、高0.1mm，体积0.1mm3（10-4ml）血球计数板的结构计数室平台方格网方格网16计数室被划分为25个中方格，每个中方格分为16个小方格，共400个小方格；上面盖上盖玻片；血球计数板的使用方法浓度约108个细胞/毫升的菌悬液，滴加在盖玻片与血球计数板平台的结合处，使菌悬液经毛细作用吸入计数室，静置，使细胞沉底；计数若干小格内的细胞数，计算每小格平均数，则：菌浓（个/ml）＝每格平均数×400×104×稀释倍数17将待测菌悬液适当稀释后，涂布在平面培养基上，培养后进行菌落计数，一个菌落相当于一个活细胞；平板菌落计数属于活菌计数法，适用于单细胞或单孢子计数，单位：菌落形成单位/mL（cfu/mL）（colonyformingunit，cfu)平板菌落计数法选择生长50～300个单菌落的平板进行计数，结果准确；18平板菌落计数方法10倍稀释法制备待测菌悬液，选择适当的稀释度，定量（0.1~0.2mL）取稀释液涂布平板，或者定量（1mL）取稀释液与融化后冷却至45℃的培养基混合倒平板；培养后，对长出的单菌落计数，根据稀释倍数，得到原菌液的生物量：cfu/mL通常选择三个稀释度涂平板，择其合适者计数；19单细胞或丝状微生物的生物量均可用直接测量湿重或干重的方法测量；离心收集细胞沉淀，无菌水充分洗涤后，直接分析天平称重—湿重（mg/ml）；洗涤后的细胞沉淀在105℃下烘干至恒重，分析天平称重—干重（mg/ml）；培养液菌体湿重约40g/L，干重约4mg/mL；湿重受培养基成分影响大，而不准确；干重法费时，灵敏度低，适于测定丝状微生物：细胞湿重和干重法20在一定范围内，菌悬液的菌体浓度与一定波长下的光密度值（opticaldensity,OD值）呈线性关系；用分光光度计，在600nm波长下，测定菌悬液的OD600值，或吸光度值（A600），可校正为1OD=n个细胞/mL；分光光度法OD值在0.2~0.8之间呈线性关系；适用于单细胞或单孢子悬液的生物量测定；21在不方便使用显微计数、平板菌落计数、细胞湿重和干重测定、分光光度测定生物量的情况下，可测定与生物量成比例关系的细胞总蛋白量，总核酸量，或者呼吸强度，间接测定总生物量，称为生理指标法；测定总蛋白：凯氏定氮法测定测总核酸：定磷法测定测呼吸强度：CO2产生量（速率）生理指标法22生长规律：二分裂殖的单细胞微生物在分批培养过程中，其生物量的增长随培养时间的变化规律：即生长过程表现出延迟期、指数生长期（对数期）、稳定期、对数衰亡期（死亡期）的规律变化；非二分裂殖或非单细胞的微生物在分批培养过程中，生长规律类似，但不典型；一般通过绘制微生物培养过程的生长曲线，反映其生长规律和生长参数；7.1.3微生物的生长规律23微生物的生长曲线生长曲线：在分批培养中，以微生物的生物量为纵坐标，以培养时间为横坐标绘制的曲线图，反映生物量随培养时间的变化；对于二分裂殖的单细胞微生物，用细胞数量的对数值为生长曲线的纵坐标；对于其它微生物可用培养液的OD值或者细胞干重作为纵坐标；24在确定的液体培养条件下，接种后，每隔一定时间取样，测定生物量，至培养结束；用生物量对培养时间作图，得到某种微生物在特定条件下的生长曲线；生长曲线的绘制方法实线为活菌计数，虚线为总菌计数25延迟期和指数生长期延迟期（lagphase）：培养的最初阶段，生物量不随培养时间增加；此阶段，细胞繁殖速率很低，细胞处于吸收营养，调整代谢的生理阶段；此阶段，细胞繁殖速率最大且稳定，细胞代谢旺盛生理状态均一；对数期（logphase）或指数生长期（exponentialgrowthphase）：生物量随培养时间呈指数曲线增长；26稳定期稳定期（stationaryphase）：生物量保持稳定，不随培养时间变化，此阶段，细胞繁殖速率与死亡速率相同，活细胞量处于动态平衡；生长到稳定期，培养基中的营养物消耗、代谢废物积累、环境条件改变；部分细胞开始衰老、死亡和自溶裂解，细胞形态多样、生理状态不均一；27衰亡期衰亡期或对数衰亡期（logarithmicdeclinephase）：活细胞数量随培养时间呈指数曲线下降，细胞几乎停止繁殖，而死亡速率达到最大；此阶段，营养物耗尽、有毒代谢物积累、环境恶化；多数细胞进入衰老、死亡和自溶状态，细胞多畸形，活细胞数量降低；287.1.4生长参数和生长过程控制描述生长过程的参数：延迟期的长短；指数期的代时和最大比生长速率；稳定期的长短、最大生物量和生长得率；可通过一定方式控制这些参数而控制生长过程；29延迟期是休眠细胞的活化期，或者是细胞代谢系统与营养和环境条件的适应期；在工业发酵中有必要采取措施缩短延迟期，而缩短发酵周期：使用活化的新鲜培养物作为菌种；使用营养丰富的天然培养基，或速效碳、氮源；使种子培养基与发酵培养基的营养物质成分相近；增大接种量，缩短延迟期；延迟期长短的控制30指数期是细胞以稳定（最大）速率繁殖的阶段，繁殖速率可用代时或倍增时间表征；代时（generationtime，G）：二分裂殖的单细胞微生物在指数期繁殖一代（分裂一次）所需要的时间；倍增时间（doubletime，D）：非二分裂殖或丝状微生物在指数期生物量增加一倍所需时间；代时或倍增时间越短，表明微生物的生长（繁殖）速率越快；代时或倍增时间与培养条件相关；指数期的代时或倍增时间(G)31代时和倍增时间的测定方法二分裂殖单细胞微生物的生长曲线纵坐标上选择指数期内细胞数量为倍数关系的两点，其对应横坐标两点之差为代时；非二分裂殖火丝状微生物在生长曲线纵坐标上取生物量为倍数关系的两点对应的时间差为倍增时间；32N0：初始细胞量；Nt：t时间的细胞量;n：从0~t时间内繁殖的代数二分裂殖单细胞微生物代时的计算公式G=————tt–t0tt–t0n=————————3.322(logNt－logN0)33微生物在确定培养条件下的代时（倍增时间）Vibrionatriegens柱胞鱼腥藻桃褐腐病菌巢状组囊藻34比生长速率（m）：在确定培养条件下，在微生物指数生长期，单位生物量单位时间内的增加量为常数，或细胞瞬时增长量与此时细胞量的比值是一个常数，表征各种微生物的生长速率：dN/dt＝mN（m的单位：mg/mg·h＝h-）lnNt-lnN0＝m(tt－t0)logNt-logN0＝m(tt－t0)/2.303μ＝(logNt－logN0)×2.303/(tt－t0)比生长速率（m）的计算35∵G=（tt-t0）／3.322（logNt－logN0）m＝（logNt－logN0）×2.303/（tt－t0）∴G＝2.303／3.322mG＝0.693／m在指数生长期，比生长速率达到最大且稳定；代时（倍增时间）最短且稳定；某种微生物的比生长速率或代时，决定于生长的营养和环境条件，是可以控制的；代时或倍增时间与比生长速率的换算关系36稳定期持续时间的延长生长到达稳定期后，营养物质浓度降低程度、有毒代谢废物的积累量、环境恶化程度决定稳定期的长短；在发酵工业中，生产次级代谢产物需要尽量延长稳定期，以便达到最高发酵单位；一般采用补充营养物，移出部分代谢产物的半连续或连续发酵方式，以及控制pH值，提高通气量等方式延长稳定期；37培养到稳定期时达到了最大生物量，以湿重或干重g/L表征；影响最大生物量的主要因素是培养基中营养物的浓度；生物量（g）碳源消耗量（g