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用色谱-质谱法研究烟草中致兴奋成分大麻素JWH-018和JWH-073的合成与代谢摘要2010年1月22日，俄罗斯政府禁止草药化合物氨基烷基吲哚JWH-018与JWH-073的分布与合成，经过详细的检测他们的代谢产物发现，在尿液中天然产物的含量极低并缺乏，说明上述成份经过尿液排泄进入到人体血液中。利用GC/LC-MS我们确定了一系列在人体和小鼠的尿液中代谢产物遵循的反应机理：（a）母体化合物与脂肪族和芳香族残基中的羟基发生单-双羟化反应，（b）羧化，（c）N-脱烷基化反应和（d）N-脱烷基化和羟基化。在人类的尿代谢物中普遍存在的是单羟基化形式，而N-脱烷烃和N-烷烃的单羟基化形式存在于小鼠尿样中。俄罗斯科学家买了26种含有JWH-018的烟草混合物用于研究。1、引言寻求与大麻素受体CB1和CB2具有高亲和力一系列氨基烷基吲哚化合物并研究它们的合成与药理活性[1]。在1998年，报道了萘-1-基-（1-戊基-1H-吲哚-3-基）甲酮（JWH-018）和它的同系物丁酯是与JWH-073有高亲和力的化合物[2]。这些化合物对CB1受体（主要位于中枢神经系统并与一个精神应答的产生有关）的亲合性是相当高的（JWH-018和JWH-073的亲和常数分别为Ki=9纳米和8.9nM）。一种大麻兴奋剂比四氢大麻酚的有效亲和力高四倍（Ki=41nm）[3,18]。在2004年该草药混合物中的成分当做外来植物（根据包装上的标签）并被称为“香料”进入了市场[4]。当他们吸烟时，这些混合物产生的效果像大麻一样，尽管它们不含有四氢大麻酚或任何其他已知的致兴奋活性物质。这些混合物在西欧的日益普及已经引起了公众的关注，并因此导致了科学家对它们化学成分的研究。在2008年十二月，THC制药公司（德国）和AGES制药公司（奥地利）独立地报道了许多对于这些混合物喷射到一种草药基础的合成成分JWH-018的检测[5]。这个结果是在西欧[6,7]和日本[8,9]进一步的被研究证实。JWH-018和吸烟引起的含JWH-018“香料”的致精神兴奋效应之间有直接联系[10]。烟草混合物通过色谱-质谱法进行分析，表明这些组分是植物本来就有的或是添加到混合物中来修改它们的属性。除了植物甾醇，科学家也对几种芳香族添加剂（乙醛香草精，丁香酚和桉油精），α-生育酚和油酸酰胺[9]进行了检测。十五种烟草混合物的定量分析表明，混合物中JWH-018的平均浓度约为15毫克/克[9]。产品中JWH-073的高含量是极其罕见的。这种化合物作为杂质（或添加剂）存在于混合物中[7,9]。根据（关于使用吸烟混合物和指令）几个专业互联网论坛的消息，80-150mg量的该混合物致兴奋效果相当于约1-2.5mg的JWH-018的效果。实际由肺部吸收数的量显然是比较低的。JWH-018量可以通过对血液中[11–13]天然化合物的检测来确定。为此，JWH-018在毫微克/毫升和低浓度时用LC–MS和高灵敏度质谱法检测。吸烟者血清中的化合物浓度迅速下降（90%的最大浓度在吸烟后三小时内消退）[11]。JWH-018和JWH-073是难溶于水和不产生亲水性的缀合物。在体外进行的类似化合物的代谢的第一项研究这些化合物的主要代谢途径可能是母体化合物的羟基化和N-脱烷基化[14]。在作者的[15]报道中，分析了JWH-018灌胃插管大鼠尿液的结果。虽然天然化合物在尿液中发现，但作者指出主要是以羟基化N-脱烷基化形式存在。在人体尿液中JWH-018代谢产物的鉴定研究中，提出了初始结构的羟基化作为主要代谢途径；然而，N-脱烷基化的代谢产物也被发现[16]。在三人的尿液样本中没有观察到天然的JWH-018，这是一个重要的研究结果。研究目的是用气/液相色谱-质谱法来确定服用过含JWH-018和JWH-073化合物的实验者的代谢物中依然含有JWH-018和JWH-073。并收集十一份用过合成大麻素的人体尿样和四份小鼠尿液样品进行分析。此外，用于研究的JWH-018（和JWH-073）烟草混合物是由俄罗斯购买提供的。2、材料与方法2.1、试剂2.2、烟草药的混合及后处理2.3、人体尿液采样2.4、小鼠动物实验2.5、尿液样本的制备利用液液萃取和固液萃取方法来制备尿液样本。液液萃取，2.5ml的尿家加到0.3ml的盐酸中，在90-95度下加热60min。向溶液中加入氨水直至溶液Ph达到8-9。将样品用3ml的氯仿萃取并离心。通过氮气流将有机相在45C度或更低温度下蒸发。将干燥好的样品溶解在50ul的乙醇中或是50ul的氰化甲烷溶液中。固液萃取，将样品装到试剂瓶中（3ml的水解尿、3ml的Ph8-9水溶液和0.6ml的氰化甲烷），吸附剂用3ml体积分数为10%-40%的氰化甲烷洗涤，然后在空气流中干燥30s，分析物用3ml丙酮洗脱，通过加入高浓度的成分的提取物空白水解尿来确定回收物。通过三次测量，回收率达到102%。通过三甲基硅烷（TMS），乙酰化作用（AC）或三氟乙酰（TFA）制备样品用于GC的衍生。25ul的BSTFA和25ul的乙酸乙酯的混合物保持在60度60min得到三甲基硅烷（TMS）。乙酰化作用是干燥的产物溶解在50ml乙酸酐和50ml吡啶的混合物中，在70度下加热30分钟，然后将混合物在真空下蒸发，再溶解在50ul的乙醇中50ul三氟乙酸酐和50ul乙酸乙酯混合物在50度30分钟得到三氟乙酰衍生物。蒸发后溶解在50ul的乙酸乙酯中。2.6、GC-MS气相色谱仪6890连接到单四极杆质谱仪5973和5975VL配备了HP-5MS（30m×0.25mm×0.25um）和EVDX-5MS（25m×0.20mm×0.33um）柱。分离物通过应用以下温度程序进行的：50度（0.5分），99◦/分钟（100度，1分钟），和60◦/分钟（320度，15分钟）。氦作为载气（分别为1ml/min和0.8ml/min）。柱温降低得到不分离化合物（35度/分钟和在最后温度300度）光谱。离子源和固体过滤器的输送管线的温度分别为290、230和150度。通过AMDIS（自动质谱解卷积和识别系统）项目（NIST，美国）手动和自动模式矫正所识别的组分的质谱图。最关键的m/z值的强度变化通过选定离子监测（SIM）模式进行了检查。2.7、LC–MS/MS(Q-TOF)液相色谱仪1200串联一个6510四极杆、渡越时间（Q-TOF）、质谱仪和芯片箱电离源用于纳流模式。将液相色谱含有丰富的芯片进行分离和分析。将富集柱装填然后用1%的甲酸水溶液洗涤（3ul/min）。样品B相组分洗脱的线性梯度以从2%至100％流动相A（0.1％甲酸的水）和B（在乙腈中的20％体积/体积相A）为48分钟，并与保持最终溶液超过2分钟。流动相流速为0.4ul/min。MS/MS的分析是由电喷雾离子化（ESI）和正离子检测。干燥气体的温度（氮气，流速5升/分钟）为325度以2000V的毛细管电压。扫描范围是从100至1000道尔顿，和经销商的MS/MS部件搜索模式与安捷伦Mass亨特工作站软件（前体和产物离子光谱的注册）中的使用。2.8、LC-MS/MS（QQQ）此方法中使用了离子扫描和选择反应监测（SRM）模式。以正模式ESI液体微柱色谱MilichromA-02与2.1mm×75mm柱连接到SCIEXAPI365三重四极质谱仪。ABSCIEX分析工作站软件使用。以下梯度系统所使用流动相A递送B速度以0.1ml/min：溶剂B30分钟内从2％至为100％，然后2分钟溶解B。3、结果与讨论3.1、烟草化合物的成分俄罗斯市场对烟草混合物的区分是根据产品的多样性。最初，吸烟的混合物被进口到俄罗斯的已知的商标，和它们的组合物对应于已发表的数据。该混合物的相对简单的制备过程，以及质量和各种成分导致大量的自制产品。这些产品，然后通过互联网或匿名分销网络销售俄罗斯的商标（或不显着）。合成公式在科学期刊上发表了在家里或在一个小实验室JWH-018的合成。在俄罗斯的JWH-018禁止（自2010年1月22日起）有LED到法律组件销售，让国产JWH-018合成。因此，最终成为依赖于一个特定的制造商的能力，个人特征和混合历史（表1）的吸烟混合物的组合物。从吸烟混合物中提取的成分可以分为五组。（1）根据所采用的技术或制造使用的产品，将致兴奋成分加入到混合物中（同系的氨基烷基吲哚JWH-018，JWH-073和环己烯苯酚羧酸酯CP-47,497C8（2-[（1R，3S）-3-羟基环己基]-5-（-2-甲基辛烷-2-yl）苯酚，C22H36O2)[6])。（2）改善或修改产品质量的成分。维生素E几乎是所有混合物中可能添加的抗氧化剂。维生素E是以下化合物的主要成分“精灵融合”，“魔力”，“香料北极协同”，“香料钻石”，“香料热带协同”，“尤卡坦消防”8，9和13（基于气相色谱法）。油酸酰胺，是一种比较罕见的对于致兴奋成分氨基烷基吲哚的表面修饰剂。烟雾中还含有相当数量的饱和与不饱和酰胺C14–C20。（3）芳香族助剂（丁香油酚，薄荷醇和香草醛衍生物）（4）许多物质是典型的草药混合物，包括尼古丁。（5）可能合成半副产物的活性成分和杂质（1-戊基-1H-吲哚，吲哚，和1-戊基萘甲酰胺-1-萘甲酸）。典型的杂质被发现在“切尔诺贝利”和“香料北极协同”确定为含有JWH-018萘残留氯原子的物质。原始混合物的成分可以通过化学方法降解为其他成分。我们的观察表明，一个假设是自制混合物（未命名的混合物3，而生育酚）被存储在室温下约一个月，JWH-018几乎完全消失。然而，监测无名的混合物4（酒精提取物），至少一个月内储存在稳定性评价房间中并没有导致任何浓度的氨基烷基吲哚的减少。3.2、GC-MS：小鼠和人的尿样检测JWH-018和JWH-073代谢产物主要由GC–MS检测和鉴定。基于这个目的，所有的样品描述中均使用该实验方法。通过电子电离得到本款规定的光谱。没有了尿液样本显示本地JWH-018和JWH-073。这些结果是与以前的观察一致的[16]，但与另一项研究矛盾[15]。这种分歧的原因可能有两种：（1）JWH-018在水中的低溶解度（根据我们的评估）和（2）作者[15]基于更灵敏分析方法的应用（LC–MS/MS）。由于其结构特点，JWH-018不能通过尿素酸共轭（作为一种天然的化合物），因此可作为一种水溶性共轭物。对分析方法的应用可以使它更敏感，可以检测人体尿液中的微量JWH-018。搜索和代谢产物的鉴定是基于相似的化合物可能的代谢途径的一般假设，提示母体结构的氧化和脱烷基反应，和以往的研究结论[14-16]。十四JWH-018代谢产物在人类和大鼠的尿液样本中发现。他们提出的结构如图1所示。表2中的线性保留指数和所研究的化合物在人类和大鼠尿样品的发生。新化合物的生理活性一般首先在实验动物研究。在这项研究中，我们可以得出结论，大鼠和人类的一般代谢途径不同。在小鼠尿液中发现的只有N-烷基化（和单羧基化的N-烷基化）代谢产物。人尿样品显示出患病的主要和次要的羟基化的产品，N-烷基化形式和内容是通过气相色谱-质谱法在尿常规分析。根据我们的测算，超过90%的羟基化代谢物以共轭的形式存在于人体尿样中，并且酶或酸分解因此被需要。SPE和LLE的样品制备分离提取物，具有很低的选择性反相SPE相关的基质化合物的量几乎相同。因此，降低成本是用于测量样品的制备方法。一种衍生方法的选择是在样品制备的主要问题。这三个应用的最佳方法是TMS（TMS，AC，TFA），在灵敏度和可观察到的代谢产物的数量方面。乙酰化也适用于常规分析，虽然灵敏度略有降低。不能推荐是因为某些衍生物具有较低的热稳定性。所有检测到的代谢产物的结构可分为四组：单羟基化，双羟化反应，羧化和脱烷基反应。每个组的化合物的鉴别将在以下做详解。3.2.1、单羟基化产物（M1-M4）人尿液中代谢物的JWH-018离子色谱图如图2所示。主要JWH-018（和JWH-073）代谢产物在我们的条件下观察到的是M1的单羟基化的形式，和羟基是应该代替一对正链质子。此假设对应于观察表明，