microRNA在各种疾病中发挥的作用

microRNA在各种疾病中发挥的作用微生物与生化药学金靖S0930580摘要MicroRNA（miRNA）是一类可负性调控基因表达的长度约为22个碱基左右非蛋白编码的RNA家族，主要功能是调节生物体内与机体生长、发育、疾病发生发展过程有关的基因的表达调控。miRNA在肿瘤、心血管疾病、糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病和艾滋病等多种疾病中都起着重要作用。本文将对miRNA与人类疾病的关系作一综述。关键词microRNA疾病TheroleofthemicroRNAinavarietyofdiseasesAbstractMicroRNAs(miRNAs)areshortnon-codingRNAsinvolvedinnegativeregulationofgeneexpression.Theirmajorfunctionistheregulationtothegeneexpressionofgrowth、developmentanddiseases.miRNAplaysanimportantroleincancer、cardiovasculardiseases、diabetes、Alzheimer’sdisease、Parkinson’sdisease、AIDSandsoon.ThisreviewsummarizestherelationbetweenmicroRNAanddiseases.KeywordsmicroRNAdiseasesMicroRNA(miRNA)是一类可负性调控基因表达的长约22nt的非编码的单链RNA分子，广泛存在于从植物、线虫到人类的细胞中，其通过碱基配对的方式结合到靶mRNA，从而抑制其翻译，但不影响其转录。最早发现miRNA是在1993年，Lee等研究人员在秀丽新小杆线虫(C.elegans)中发现了控制着线虫时序性发育的lin-4。2000年，Reinhart等发现了另一个具有转录后调节功能的小分子RNA：let-7。随后的几年时间里，许多研究人员相继发现了这类RNA。目前，在各物种中共发现4,449个miRNA，其中在人类中发现并已经得到实验证实的有474个。这些miRNA的功能主要是调节生物体内与机体生长、发育、疾病发生过程有关的基因的表达，对miRNA的深入研究，势必有利于我们对生物体生理、病理机制的理解，并为疾病的诊断和治疗提供理论基础和新思路。[1]1miRNA的发现1993年Lee等在对秀丽新小杆线虫(C.elegans)进行突变体的遗传分析中意外发现一种控制细胞发育时序的长度约为22nt的小分子非编码单链RNA-lin-4；2000年Reinhart等在线虫中发现了另一种重要的具有转录后调节作用的miRNA-let-7。lin-4和let-7即是首先被确认的miRNA，它们通过部分序列结合到目的miRNA靶的3'UTR，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，通过调控一组关键mRNA的翻译调控线虫发育过程。随后对miRNA的研究不断增加，多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNA，预计大约有1000种人类miRNA参与近三分之一人类蛋白编码基因的调控。[2]1.1定位克隆目前，已知的miRNA基因多是通过定位克隆的方法发现的。定位克隆miRNA分子的简要步骤：细胞裂解，获得总RNA；变性胶分离并纯化19～25nt的小RNA；小RNA分子通过分离、纯化与3′和5′寡聚核苷酸接头连接；进行RT-PCR获得cDNA；cDNA连接载体，构建cDNA文库；筛选克隆进行测序，获得miRNA序列。该方法常受其他小分子(如siRNA)的影响，易产生假阳性。[3]1.2生物信息学方法生物信息学方法是依据成熟的miRNA基因(具有较大的序列同源性以及前体的茎环结构)在种属间具有高度的保守性特点，以某些miRNA基因保守结构的特点为基础设计计算机程序，扫描基因组序列以鉴定潜在的miRNA基因的方法。该方法根据比较基因组学原理并结合生物信息软件，以序列为基本框架在不同种属间进行序列比对，找寻可能的miRNA基因。根据同源性的高低再进行RNA二级结构预测，将符合条件的候选miRNA基因与已经通过试验鉴定的miRNA分子进行比较分析，最终确定该物种miRNA的分布及数量。XieX等人在人、小鼠、大鼠和狗的基因组比对分析中指出，3′-UTR存在大量的调节结构域，且近一半的调节结构域与miRNA有关。其中miRNA5′端的2～8个核苷酸为“种子区”，其对于miRNA与3′-UTR的配对非常重要。miRNA的“种子区”能很好地与靶序列配对，靶序列在不同物种中通常十分保守，“种子区”在同源的miRNA中很保守。因此，可用“种子区”序列预测未知的miRNA基因。目前，国际上计算机分析工具已被广泛地应用于许多物种候选基因的筛选。它们鉴别出的基因中有相当一部分都在试验中得到验证，这一方法由于灵敏度高，也已被应用于人类miRNA基因的寻找。生物信息学与生物芯片及定位克隆技术相结合也可预测miRNA基因，BentwichI等通过计算机在整个人类基因组中筛选出一些可折叠为发夹结构的序列，从40多万个潜在的miRNA中挑选了首批5300个“代表”，借助高通量生物芯片在胎盘、睾丸、胸腺、前列腺和脑组织中进行筛选，发现其中有886个表达，通过选择其中359个进行克隆与测序，研究者们鉴别出89种新的miRNA，从这些结果中推断人类基因组中至少有800个miRNA。[3]2miRNA的特征和作用机制2.1miRNA的特征研究表明，miRNA有以下几个明显特征：①miRNA是一种长度为19～25nt的单链小分子，广泛存在于真核生物中，是一组非编码短序列RNA，其本身不具有开放阅读框架(ORF)，但在3′端可以有1～2个碱基的长度变化，对miRNA的具体长度范围尚无统一标准，在拟南芥和烟草中发现的26ntRNA，在四膜虫(Tetrahymenas)中发现的能使大部分DNA失活的28ntRNA也被归于其中；②其前体具有发夹或折叠的二级结构，不含有大的内部环状结构和突起，且成熟的miRNA应位于发夹结构的颈部；[1]③miRNA能够互补配对结合于基因序列的侧翼区域，成熟的lin-4和let-7与靶mRNA的3′非翻译区互补结合可抑制靶mRNA的翻译；④由核酸酶Dicer作用于前体的双链而生成的产物含有3′羟基和5′磷酸的核苷酸片段，这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA的降解片段区别开来；⑤大多数miRNA基因以基因簇形式存在于基因组中，它们多以顺反子的形式转录出前体转录本，且大部分位于独立的转录单位中，人类miRNA基因分布于除Y之外的所有染色体中；⑥miRNA在物种间具有高度的保守性、时序性和组织特异性。约12%的miRNA在线虫、果蝇、哺乳动物和植物中呈现保守性。序列比较发现这些保守序列只有1～2个碱基的差异，mir-1、mir-34和mir-87在无脊椎动物和脊椎动物中高度保守。[3]2.2miRNA的作用机制已知动物miRNA靶基因中miRNA的结合位点通常有多个，例如lin-14基因有7个靶点，并且总在3’-UTR。然而，这对发现动物miRNA结合位点可能有偏颇，因为这主要建立在使用仅有3’-UTR序列构成数据库的计算机预测基础上，这些结合位点的数量和互补性可能与翻译减弱的程度有关。如果仅有一个位点结合，表达减弱；但是如果所有位点都结合，翻译就完全抑制。实际上协同翻译抑制已经通过在3’-UTR添加多个结合位点而得到证实。再者翻译抑制具有可变的调节性和可逆性，即miRNA从结合位点移去miRNA又可翻译。相反，在编码区裂解就永久破坏了mRNA，产生了只有mRNA重新转录才能逆转的彻底抑制。miRNA转录后抑制的确切分子机制在很大程度上仍然未知。研究的最好例子之一是lin-4，它通过翻译抑制负调控靶基因lin-14。lin-4和lin-14碱基配对对其在体内的相互作用非常关键，因为影响它们互补的突变体会减弱或丧失该负调控作用。令人感兴趣的是lin-4仅抑制lin-14蛋白的合成，而不影响lin-14mRNA的合成丰度。而且，在存在lin-4的情况下，lin-14翻译起始似乎正常发生，因为即使lin-4表达，lin-14mRNA仍能有效地形成多聚核糖体。因此，推测lin-4翻译抑制发生在翻译起始后，可能在翻译延伸和（或）lin-14蛋白释放过程。靶基因的翻译抑制并不是lin-4所特有，目前研究表明，在整个动物界，靶基因的翻译抑制是通过miRNA负调控其靶标的主要调控机制。尽管大多数动物miRNA抑制靶基因的翻译，然而，一个新发现的哺乳动物miRNA---miR-196，与其靶标Hoxb8几乎完全配对，直接介导鼠胚胎和培养细胞中Hoxb8mRNA的裂解。所以，miRNA与目的基因的作用方式有2种，miRNA以何种方式与目的基因作用，同miRNA与目的基因的配对程度有关。miRNA与目的基因不完全配对时，就以抑制目的基因翻译的方式作用；miRNA与目的基因某段序列配对完全时，就可能引起目的基因在互补区断裂而导致基因沉默。[4]3miRNA与疾病的关系3.1miRNA与肿瘤的关系3.1.1miRNA与肿瘤的发生发展目前已经识别和鉴定的人类miRNA序列有321个，其中234个被实验证实。多数miRNA定位在与肿瘤相关的染色体部位，miRNA的异常表达与特定肿瘤有关，可以调控重要的肿瘤相关基因，参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭或血管形成等过程。这些迹象表明，miRNA在人类肿瘤发生、发展中发挥了重要作用。[5]认为，miRNA在肿瘤发生中的作用主要在于3个方面：(1)有些编码miRNA的基因可能起着癌基因的作用；(2)有些miRNA基因则可能起到抑癌基因的作用；(3)一些致瘤病毒编码的miRNA也可能参与相关肿瘤的发生。[6]以往的研究发现蛋白编码基因的异常会导致肿瘤的发生发展，自2002年11月Croce研究组首次报道miRNA异常与肿瘤相关，越来越多的证据显示miRNA在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。有关miRNA的研究，为更全面深入地了解肿瘤的发病机理提供了新的思路。[7]多个研究小组利用microarray和磁珠杂交技术发现良性和恶性肿瘤中miRNA的表达水平发生改变，但是miRNA表达水平的改变是肿瘤发生的“因”还是“果”尚不清楚。相对于正常组织，有些miRNA的表达水平在肿瘤组织中发生明显下调，如肺癌中的let-7；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中的miR-15a/miR-16-1表达簇；结肠癌中的miR-143/miR-145。有些miRNA的表达水平则在肿瘤组织中发生明显的上调，乳头状甲状腺瘤、恶性胶质瘤中的miR-221/miR-222；睾丸生殖细胞瘤中的miR-372/miR-373；乳腺癌、肺癌中的miR-21；霍金森淋巴瘤、B细胞型淋巴瘤中的miR-155。[8]目前认为引起miRNA在肿瘤中表达水平发生改变的可能原因：(1)50％的miRNAs位于或靠近基因组中肿瘤相关的脆性区域，即经常发生缺失、扩增、易位的染色体片段，如在慢性淋巴细胞性白血病中表达降低的miR-15a/miR-16-1，位于肿瘤中经常缺失的13q14，在淋巴瘤中上调的miR-17-92表达簇，位于肿瘤中经常发生扩增的13q31；(2)由于异常甲基化造成的miRNA转录水平的明显改变，如在前列腺癌、膀胱癌中的miR-127；(3)miRNA加工过程的关键蛋白的表达异常，如肺癌中Dicer表达水平的下调；(4)miRNA前体上的突变或多态影响miRNA的加工成熟：如miR-15a/16-1前体上游7bp的C/T多态位点，位于miR-125a成熟体的G/T多态位点。肿瘤中常呈现蛋白编码基因的突变，至今为止只有两篇文献报道在肿瘤组织中检测miRNA前体序列的改变，其中Croce小组在75例CLL中分析了42个miRNA，共计在11例样本中发现5种miRNA胚系突变。我们实验室在96例肝癌组织中分析了59个miRNA前体序列，没