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miRNA腺病毒操作手册miRNA简介MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为18-24个核苷酸的非编码RNA分子。MiRNA通过与靶基因mRNA上的互补序列结合，降解mRNA或抑制mRNA的翻译。MiRNAs在细胞分化、增殖、凋亡和癌细胞发生中发挥重要的调控作用。MiRNAs来源于具有60-80个核苷酸茎环结构的microRNA前体（premir）和序列更长一些的microRNA初级转录产物（primir）。MiRNA在核内由RNA聚合酶II（polII）转录生成，最初产物primir具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴。ViGene生物的mirAD-腺病毒microRNA前体表达系统包括三个相关产品：microRNA前体穿梭载体、microRNA前体腺病毒载体和预制microRNA前体腺病毒。microRNA前体腺病毒简介重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，功能强大且易于操作。腺病毒独特的生物学特征使它成为“载体的首选”，被科研工作者广泛应用。首先，它能够感染包括分裂、非分裂细胞和干细胞在内的多种细胞。第二，病毒滴度高。第三，高滴度的病毒可获得高感染效率和高表达量。第四，病毒进入细胞后，病毒基因组不整合到细胞染色体上，因此瞬时表达外源基因的重组腺病毒不会诱导宿主细胞中染色体的变化。ViGene生物选用的是应用最广泛的复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，该腺病毒载体缺失E1和E3基因。E1基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少，可在HEK293T细胞病毒包装过程中得到补充，而E3基因可有可无。由于E1和E3基因的缺失，腺病毒载体可插入高达7.5kb的外源基因。pMir-microRNAprecursor是基于microRNA前体表达系统的质粒。microRNA前体天然的茎环结构被克隆到质粒的SgfI和MluI双酶切位点。为了保持推测的发卡结构和诱导正确的内源性反应，miRNA茎环结构的两侧具有它的150-200bp的天然序列。MicroRNA前体在CMV启动子启动下表达，其上游有GFP荧光标记，并具有SV40poly（A）加尾信号。穿梭载体含有SV40启动子启动的puromycin嘌呤霉素标记，可以用来进行稳转细胞株的筛选。穿梭载体还含有两个腺病毒ITR序列和两个与腺病毒Ad5同源的序列，可用于将microRNA前体同源重组到腺病毒载体。microRNA前体腺病毒载体通过在大肠杆菌中同源重组，将microRNA序列从pEnter和除慢病毒、腺相关病毒之外的大部分的目的载体转移至pAD腺病毒载体。pAD是最常用的人类腺病毒载体，是人类腺病毒血清5型，E1和E3基因的缺失。pAD-ORF质粒可用于在HEK293细胞中包装重组腺病毒。（维真生物，12000个腺病毒现货可第二天发货）microRNA前体腺病毒是microRNA前体的重组腺病毒表达系统。ViGene的预制microRNA腺病毒能够最有效地传递microRNA前体，可应用于microRNA体外和体内的功能研究。产品组成产品主要包括以下部分:1.pMir-microRNA前体甘油菌液。100ul.2.pAD-microRNA前体甘油菌液。100ul.3.MirAd-microRNA前体腺病毒。每100ul含有108个病毒颗粒保存条件收到产品后，请将所有产品-80ºC保存。miRNA质粒图谱（维真生物）质粒扩增pMir-microRNA前体或pAD-microRNA前体的甘油菌液在含30ug／ml卡那霉素LB固体培养基上活化并37℃培养过夜。第二天，至少挑取3个克隆进行质粒小提。用引物GFP-F对pMir-microRNA前体或pAD-microRNA前体进行5’端测序，测序位点位于接头上游85nt。病毒载体扩增用包括MicroRNA前体腺病毒在内的病毒感染HEK293细胞，对病毒进行扩增。每轮扩增可使病毒滴度增加10倍。注：以下步骤建议使用T75培养瓶，可根据实际情况优化具体参数。1.转染前一天，在T75培养瓶中接种3-5×106HEK293T细胞。2.取1/2体积的粗提病毒裂解液至培养细胞中。建议使用PFU（空斑形成单位）0.5或足够在48h内产生病毒细胞病变效应（CPE）的病毒量。3.感染后24-48h，每天显微镜下镜检两次，检查单层细胞是否出现细胞病变效应CPE。当CPE接近完成（即大多数细胞圆形但尚未从瓶上脱落），用移液管将瓶上的细胞吹洗至培养液中。4.收集细胞和培养液。1000g离心5min收集细胞。除去上清液，悬浮细胞用10mMTris，pH值8.0，NaCl100mM重悬。（T75培养瓶0.25-0.5ml/瓶）。5.反复冻融细胞3次释放病毒颗粒。3000g离心10min，除去细胞碎片。弃沉淀，保存上清液中的病毒。6.病毒上清-80°C冻存或立即进行纯化和滴度测定。常见问题解答1.在使用和操作腺病毒载体时应注意哪些安全性问题？mirAd腺病毒载体是复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，E1和E3基因缺失。使用腺病毒载体前请向您所在机构的生物安全部门征得许可和指令。应在BL2生物安全二级实验室操作病毒粒子。使用新鲜配制的10％漂白粉进行消毒操作。操作腺病毒和转染细胞时应始终佩戴手套。2.在什么情况下我该选用腺病毒载体作为将microRNA前体导入细胞的工具？您应先考虑以下几点：1.外源基因需要瞬时表达还是稳定的基因表达？2.需转染分裂细胞还是非分裂的细胞？3.对于靶细胞的潜在免疫原性4.病毒用来进行体内还是体外基因传递？腺病毒载体能感染分裂和非分裂细胞。它适用于体内和体外基因传递，转染效率高，对外源基因瞬时表达量高。但相对于其他病毒载体系统，腺病毒载体在靶细胞中具有相对较高的免疫原性。3.VP，PFU，IFU的区别是什么？我设计的实验该选用哪个指标？VP(Viralparticles)反映了病毒颗粒的总数（包括活病毒和死病毒）。由于在病毒制备过程中，每次死病毒的比率各不相同，VP并不能真实反映有活性的病毒数量。PFU（plaqueformationunit）代表具有感染活性的病毒数量。通常情况下，VP/PFU比值为20:1至50:1。IFU（infectiousunit）相当于PFU。我们建议您选用PFU或IFU作为病毒滴度单位，可获得较为一致的实验结果。4.病毒滴度如何测定?测定腺病毒的滴度有三种常用的方法：（1）空斑形成实验（2）终点稀释实验（3）BAC法空斑形成实验是一种检测有感染能力的病毒（PFU）的生物学方法。通常是用一系列病毒稀释液感染单层HEK293细胞，病毒在感染的细胞中繁殖，最终导致细胞毒性效应并被释放出来。释放的病毒将感染邻近的细胞，这整个过程将被不断重复，最终导致空斑的形成。为了阻止病毒扩散并形成新的空斑，在完成最初感染后，要将一层0.5%的琼脂铺在细胞表面上。病毒滴度（PFU/ml）可通过统计空斑数目获得。空斑的形成需3周时间。终点稀释实验类似于空斑形成实验，但更为复杂。病毒滴度的计算公式也较为复杂。BAC法是检测蛋白浓度，仅适用于纯化后的腺病毒。通常1ug蛋白=1X109VP。5.通过CsCl双重梯度法纯化和浓缩病毒有必要吗？如果病毒被用于体外细胞实验，不需要进行CsCl双重梯度法纯化。由于未纯化病毒液中含有的细胞碎片和少量培养基成分易诱导显著的免疫学反应，用于体内实验或动物实验的病毒需通过CsCl双重梯度法纯化和浓缩病毒液，从而除去有缺陷的病毒颗粒和其他培养基中的成分。6.如何保存重组腺病毒?腺病毒可在-80°C条件下，稳定保存6个月至一年。7.mirAd是什么血清型的腺病毒?MirAd腺病毒是E1/E3基因缺失的人类血清5型腺病毒。8.什么是RCAs？如何检测RCAs?HEK293细胞中存在与血清5型腺病毒相同的序列，重组腺病毒与293细胞的重叠序列交叉重组，可产生复制能力的腺病毒（ReplicationCompetentAdenoviruses：RCAs），RCAs发生的几率较小。RCA可使用非辅助细胞，如HeLa进行检测。将梯度稀释的病毒液感染HeLa细胞，并培养8天。8天后，若没有空斑产生，重组的腺病毒则不是有复制能力的腺病毒。9.MirAdmicroRNA前体的序列是什么?mirAdmicroRNA前体序列是由primirs（60-80nts）和150-200nts的两侧基因组序列组成。两侧基因序列应至少75nts，才能保证primir和miRNA的正确表达。10.如何检测miRNA?从转染的细胞中提取包括小RNAs的总RNA，用适当的接头和microRNA特异性引物进行RT-qPCR，扩增并检测microRNA的表达。11.每个质粒只表达一个microRNA吗？是的，每个microRNA前体只表达一个microRNA的发夹序列。