KGF对肠上皮细胞IL-7表达调控及对缺血再灌注损伤条件下肠黏保护作用及其机制研究-杨桦

作者单位：400037重庆，第三军医大学新桥医院普通外科，通讯作者：杨桦，Email:[e-mail]基金项目：国家自然科学基金重点项目(NSFC81330013)，国家自然科学基金面上项目(NSFC81272078),国家教育部创新团队项目基金（教技函[2013]59号）KGF对肠上皮细胞IL-7表达调控及对缺血再灌注损伤条件下肠黏保护作用及其机制研究邱远，蔡瑜娇，王文生，陈国庆，许超，孙力华，肖卫东，杨桦*【摘要】目的肠道急性缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤可引起肠黏膜上皮细胞脱落，肠黏膜通透性增加，引起细菌、毒素入血，从而引发严重的并发症。尽管已知角质生长因子(KGF)对肠黏膜细胞生长具有重要作用，但其在肠道急性I/R损伤中的作用及机制尚不清楚。方法肠梗阻病例的肠道组织用于形态学分析，并用免疫荧光的方法检测IL-7的表达。用KGF作用LoVo细胞和C57BL/6J小鼠。用WB和免疫荧光的方法检测KGF、KGF受体（KGFR）及IL-7的表达。结果肠梗阻致缺血肠道KGF，IL-7表达下调；在体内和体外研究中发现，KGF可上调IL-7的表达；在LoVo细胞中，KGF作用引起磷酸化STAT1表达升高，用雷帕霉素或AG490阻断后，KGF的作用不能上调磷酸化STAT1和IL-7的表达；同时，KGF可上调IRF-1和IRF-2的表达；KGF可以显著改善急性I/R所致的肠黏膜形态的损伤及紧密连接蛋白正常表达结构的破坏。结论在急性I/R小鼠模型中，KGF对I/R所致的肠黏膜形态及肠黏膜屏障功能损伤具有明确的保护作用。KGF可上调IL-7的表达，这一调控是通过KGFR/STAT1/IRF-1,IRF-2通路实现的。本研究首次提出KGF通过KGFR/STAT1/IRF-1,IRF-2通路调控IL-7的表达，并参与调节肠黏膜屏障功能。【关键词】角质细胞生长因子（KGF）；白介素7（IL-7）；缺血再灌注（I/R），小鼠，肠上皮细胞；肠黏膜屏障功能；信号传导与转录活化因子(STAT1)；干扰素调控因子1和2（IRF-1,IRF-2）KeratinocyteGrowthFactor-inducedSignalsUp-regulateInterleukin-7ProductionandImproveIntestinalStructureandFunctioninIntestinalIschemia/ReperfusionInjuryYuanQiu,YujiaoCai,WenshengWang,GuoqingChen,ChaoXu,LihuaSun,WeidongXiao,HuaYang*Backgrond&Aims:Thepathogenesisofintestinalischemia/reperfusion(I/R)isbelievedtoinvolveanalterationofepithelialstructureandfunction.KeratinocyteGrowthFactor(KGF)mediatestheenterocytemitosisandincreasesintestinalgrowth.WehaveinvestigatedtheroleKGFplaysinregulatingintestinalepitheliumhomeostasisinresponsetoI/Rinjury.Methods:KGFandIL-7expressionwereevaluatedinintestinaltissuesamplesfrompatientswithintestinalobstruction.LoVocellsandadultC57BL/6JmiceweretreatedwithKGF.ExpressionofP-Tyr-STAT1,STAT1,andIL-7byinhibitingSTAT1andalterationsofexpressionofIRF-1,IRF-2andIL-7weremeasuredwithwesternblot.Epithelialcell(EC)proliferationandapoptosiswereassessed.Tightjunctions(TJ)weredetectedbywesternblotandimmunohistochemistry.Results:IntestinetissuefrompatientswithintestinalobstructionexpressedsignificantlylessKGFandIL-7thancontrols.KGFtreatmentledtoincreasedlevelsofP-Tyr-STAT1andIL-7expression.IRF-1andIRF-2expressionwerealsoup-regulatedbyKGF,andIL-7expressionwasdecreasedafterIRF-1andIRF-2weresilenced.MiceinjectedwithKGFwereprotectedagainstintestinalI/R;KGFstimulatedtherecoveryofmucosalstructuresandattenuatedthedisrupteddistributionofTJproteins.Conclusions:KGFandIL-7aredown-regulatedinintestinaltissueofpatientswithintestinalobstruction;KGFsignaling,viatheSTAT1/IRF-1,IRF-2signalingpathway,up-regulateIL-7expressioninEC.KGFadministrationimprovestheepithelialstructureandbarrierfunctioninamousemodelofintestinalI/R.Keywords:Keratinocytegrowthfactor(KGF);Interleukin-7(IL-7);ischemia/reperfusion(I/R);mouse;intestinalepithelialcells;intestinalbarrierfunction;signaltransducersandactivatorsoftranscription1(STAT1);interferonregulatoryfactor1(IRF-1)andinterferonregulatoryfactor2(IRF-2).肠道缺血再灌注（Intestinalischemia/reperfusion，I/R）所致损伤常见于多种临床疾病，如机械性肠梗阻，出血性休克、小肠移植、心肺转流术、腹部主动脉手术及血管手术等，严重时可诱发败血症及多器官功能衰竭，从而威胁患者的生命。肠道I/R损伤是一个涉及多个病理生理反应机制的复杂过程，包括全身的和局部的损伤，在这个过程中，最直接的是对肠黏膜的损伤[1]。这种急性I/R所致的肠黏膜损伤包括黏膜上皮的脱落、细菌移位、黏膜通透性改变及吸收功能的异常，进而导致全身炎性反应综合征、败血症及多器官功能衰竭，严重者引起患者死亡。角质化细胞生长因子（keratinocytegrowthfactor，KGF），又称为FGF7，最早是从人胚胎肺成纤维细胞系M426中分离出来，具有促进上皮细胞分裂的作用。最初发现，KGF具有增强多种上皮细胞有丝分裂活性的作用。成年大鼠给予重组KGF后，发现大鼠全消化道肠黏膜上皮细胞及肝细胞显著增殖，并且杯状细胞的数量也显著增加[2]。在短肠综合征（SBS）发生时，作为一种适应性代偿的改变，由小肠隐窝细胞增殖始动，产生小肠黏膜吸收面积及体积的增加，同时可促进肠上皮细胞的增生及分化[3]。在广泛性肠切除（massivebowelresection）手术后给予外源性KGF，发现小肠黏膜湿重增加了约20%，表现在小肠黏膜厚度、绒毛高度及隐窝深度的增加，黏膜形态学的改变同时伴随着黏膜DNA、蛋白含量及酶活性的增加[4]。另外，我们的前期研究也证实了广泛性肠切除可促进小肠黏膜KGF表达上调，进一步研究发现，在SBS发生后，肠上皮间淋巴细胞（intraepitheliallymphocyte，IEL）来源的KGF表达上调，而IEL来源的KGF表达主要在隐窝部位，但在绒毛的底部及顶部KGF表达不明显，对-TCR－IEL敲除小鼠的研究发现，小肠黏膜萎缩达22%，说明IEL来源的KGF对维持肠上皮细胞的增殖和生长具有重要作用[5]。研究进一步发现，KGF刺激显著促进了Na+和Na+耦联的营养物质如葡萄糖、丙氨酸的吸收，增强了肠道的吸收功能。研究还发现KGF不仅可以抑制胃酸的分泌，还可以促进胃肠黏膜上皮细胞的增殖与分化以促进溃疡面的愈合[6]。我们前期的研究发现，在全胃肠外营养（TPN）的小鼠模型中，给予KGF能显著增强肠黏膜屏障功能，并且KGF能减轻化疗及放疗引发的黏膜损伤[7]。以上研究结果提示，KGF在肠黏膜慢性损伤中对肠功能的保护及损伤修复起重要作用；但其在急性I/R条件下对肠道的作用尚不清楚，在本研究中，我们将探讨KGF对急性I/R所致的肠黏膜结构及功能的损伤的保护作用[8]。多项研究发现，肠上皮细胞通过与邻近的IEL的对话在肠黏膜免疫反应中发挥着重要作用。近来研究发现，IL-7在IEL的分化和成熟过程中起着重要作用，IL-7在肠黏膜免疫中的重要作用表现在其在促进T淋巴细胞的成熟过程中发挥特殊的作用，这一特殊作用是其他因子不能取代的[9]。在IL-7表达缺陷时，幼稚T细胞的增殖被抑制，并且数量也显著下降。在体内研究中发现，给与小鼠IL-7后，IEL的功能及数量都发生明显改变，表现为IEL数量的增加和细胞亚型的改变，而在IL-7过表达的TPN转基因小鼠模型中，IL-7过表达能减缓TPN所致多种IEL的细胞亚型的改变及对功能的影响[10]。以上研究结果提示：IL-7参与了IEL的生长过程并维持其作用的发挥，在肠免疫反应中发挥着重要的作用，但其调控的机制目前尚不清楚。我们在前期的研究中发现，IL-7过表达的转基因小鼠模型肠黏膜组织的KGF表达上调，首次提出KGF和IL-7这两个在肠道均具有重要作用的因子存在，并在IEL与IEC对话中扮演重要角色，即可能存在交互对话（CrossTalk）[11]。由于之前的研究并未涉及对IEC来源的IL-7的调控作用及相关机制，在本研究中，我们将就KGF对IL-7表达的调控作用及其调控机制进行研究。1.材料与方法1.1病例选择：37例患者因小肠梗阻行小肠部分切除术。在手术切除标本中取少量组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片、HE染色，具体方法同上，做病理学分析。1.2实验动物及分组：实验动物：无特定病原，6-8周，C57BL/6J雄性小鼠，由本校动物实验中心提供。实验前在本所动物室饲养，恒温、恒湿及规定光照，普通鼠饲料喂养。实验前自由饮水。随机将实验动物分为假手术组（Sham组、I/R组及I/R+KGF组。其中，I/R组及I/R+KGF组分为0h，6h，24h，72h四个时相点[12,13]。KGF组小鼠的给药方法是：术前KGF（5mg/kg/d）腹腔注射×5天。每组小鼠各六只。对照组注射生理盐水。1.3检测方法1.3.1H.E.染色及免疫组化：组织石蜡切片二甲苯脱蜡和系列乙醇浓度梯度水化，苏木精染液染色，酒精脱水，二甲苯透明处理后中性树胶封固。免疫组化：常规对石蜡包埋的切片脱蜡脱水，蛋白酶K（20μg/ml溶于Tris/HCl中，pH7.4-8.0）室温孵育15-30min，PBS冲洗切片，滴加50μl的一抗反应混合溶液，在湿盒中37℃孵育，PBS冲洗切片3次，滴加二抗，在湿盒中37℃孵育30min，PBS冲洗切片3次；加入50-100μlD