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Ⅶ国家自然科技资源平台微生物菌种常规保藏技术规程（试行）《自然科技资源收集、整理、保存技术规程研究与制定》项目组二〇〇四年十二月十日Ⅶ2目次前言………………………………………………………………………………………2引言………………………………………………………………………………………31范围…………………………………………………………………………………………42定义…………………………………………………………………………………………43基本原则……………………………………………………………………………………54方法…………………………………………………………………………………………5附录A定期移植保藏法…………………………………………………………………6附录B液体石蜡保藏法…………………………………………………………………9附录C沙土管保藏法…………………………………………………………………11参考文献……………………………………………………………………………………13Ⅶ3前言本规范由国家自然科技资源平台建设项目提出。本规范起草单位：中国农业科学院土壤肥料研究所、中国食品发酵工业研究院、中国兽医药品监察所、中国科学院微生物研究所、中国林业科学研究院森林保护研究所、中国药品生物制品检定所、中国医学科学院医药生物技术研究所。本规范主要起草人：程池、李金霞、胡海蓉、姜瑞波、顾金刚、周宇光、朴春根、叶强、张月琴、陈敏等。Ⅶ4引言微生物菌种常规保藏是一类重要的基本操作技术，广泛应用于科学研究、教学及生物技术产业，是保护微生物菌种资源的重要手段，是科研教学及生物技术产业正常运转的重要保障。本规程包括定期移植保藏法、液体石蜡保藏法和沙土管保藏法三种常用微生物菌种保藏方法。制定本规程是为了规范微生物菌种常规保藏技术操作，加强管理，以达到保护微生物菌种资源，利用微生物菌种资源及实现资源共享的目的。Ⅶ5微生物菌种常规保藏技术规程1范围本规程规定了微生物菌种常规保藏技术的基本原则和方法。本规程适用于微生物菌种的常规保藏工作。2定义本规程采用下列定义。2.1微生物菌种资源microorganismresources指可培养的有一定科学意义、具有实际或潜在实用价值的古菌、细菌、真菌、病毒、细胞株等及其相关信息数据。2.2菌种保藏culturepreservation是指将微生物菌种用各种适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定。2.3定期移植保藏法subculturing亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4℃－6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。2.4液体石蜡保藏法preservationunderliquidparaffin亦称矿物油保藏法,定期移植保藏法的辅助方法。是指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至菌种长出健壮菌落后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于4℃－15℃进行保存的一种菌种保藏方法。2.5沙土管保藏法sandpreservation亦称载体保藏法。是指将培养好的微生物细胞或孢子用无菌水制成悬浮液,注入灭菌的沙土管中混合均匀，或直接将成熟孢子刮下接种于灭菌的沙土管中，使微生物细胞或孢子吸Ⅶ6附在载体上，将管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于4℃－15℃进行保存的一种菌种保藏方法。3基本原则3.1应针对菌种特性选择适宜方法进行保藏。3.3应保证菌种保藏的安全性，不能对周围环境造成污染和危害。4方法4.1定期移植保藏法见附录A。4.2液体石蜡保藏法见附录B。4.3沙土管保藏法见附录C。Ⅶ7附录A定期移植保藏法A.1适用范围本方法适用于大多数细菌和真菌。A.2原理低温条件下保藏可减缓微生物菌种的代谢活动，抑制其繁殖速度，达到减少菌株突变，延长菌种保藏时间的目的。保藏培养基一般含较多有机氮，糖分总量不超过2%，既能满足菌种培养时生长繁殖的需要，又可防止因产酸过多而影响菌株的保藏。A.3技术要求A.3.1不同菌种应根据要求选择合适的培养基。A.3.2接种时要求无菌操作，避免染菌。A.3.3保藏期间要定期检查菌种存放的房间、冷库、冰箱等的温度、湿度，各试管的棉塞有无污染现象，如发现异常应取出该管，重新移植培养后补上空缺。A.3.4大量菌种同时移植时，各菌株的菌号、所用培养基要进行核对，避免发生错误。A.3.5每次移植培养后，应与原保藏菌株和菌株的登记卡片逐个对照，检查无误后再存放。A.3.6斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。A.4方法与步骤A.4.1培养基制备A.4.1.1器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，根据不同情况洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。A.4.1.2溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量。A.4.1.3调pH值Ⅶ8配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸或稀碱调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。A.4.1.4加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。A.4.1.5过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装，斜面培养基不宜超过试管高度的四分之一。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。A.4.1.6包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。A.4.1.7灭菌根据要求将培养基灭菌。灭菌后摆放斜面时，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。A.4.1.8无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验。A.4.2接种A.4.2.1斜面接种A.4.2.1.1点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。A.4.2.1.2中央划线从斜面中部自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。A.4.2.1.3稀波状蜿蜒划线法从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。A.4.2.1.4密波状蜿蜒划线法从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌等。A.4.2.1.5挖块接种法挖取菌丝体连同少量琼脂培养基，转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类真菌。A.4.2.2穿刺接种Ⅶ9用直接种针从原菌种斜面上挑取少量菌苔，从柱状培养基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途径慢慢抽出接种针。适用于细菌和酵母菌等。A.4.2.3液体接种挑取少量固体斜面菌种或用无菌滴管等吸取原菌液接种于新鲜液体培养基中。A.4.3培养将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到成熟孢子。A.4.4保藏A.4.4.1保藏温度和时间培养好的菌种于4℃－6℃保存，根据要求每3－6个月移植一次。对于某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，须1－3个月移植一次。A.4.4.2保藏湿度用相对湿度表示，通常为50%－70%。测量仪表采用毛发湿度计或干湿球湿度计。A.4.5移植培养将培养物转接到另一新鲜培养基中，再在适宜条件下培养。A.4.6菌种复壮菌种如有退化，应将退化的菌种引入原来的生活环境中令其生长繁殖，通过纯种分离，在宿主体内生长等方法进行复壮。Ⅶ10附录B液体石蜡保藏法B.1适用范围本方法适用于不能分解液体石蜡的酵母菌、某些细菌(如芽孢杆菌属，醋酸杆菌属等)和某些丝状真菌(如青霉属，曲霉属等)。B.2原理液体石蜡保藏法可作为定期移植保藏法的辅助方法。在液体石蜡覆盖下，菌种的生物代谢受到抑制，细胞老化被推迟。此方法可阻止氧气进入，使好气菌不能继续生长，也可防止因培养基的水分蒸发而引起的菌体死亡，达到延长菌种保藏时间的目的。B.3技术要求B.3.1菌种培养参照附录A。B.3.2应选用优质化学纯液体石蜡。B.3.3液体石蜡易燃，在对液体石蜡保藏菌种进行操作时注意防止火灾。B.3.4保藏场所应保持干燥，防止棉塞污染。B.3.5保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充灭菌的液体石蜡。B.4方法与步骤B.4.1液体石蜡将液体石蜡分装加棉塞，用牛皮纸包好，0.1MPa灭菌30分钟取出，置40℃恒温箱蒸发水分，经无菌检查后备用。B.4.2斜面培养物的制备参照附录A，斜面宜短，不超过试管三分之一为宜。B.4.3灌注石蜡无菌条件下将灭菌的液体石蜡注入刚培养好的斜面培养物上，液面高出斜面顶部1厘米左右，使菌体与空气隔绝。B.4.4保藏将注入石蜡油的菌种斜面直立存放于低温(4℃-15℃)干燥处，保藏时间为2-10年不等。Ⅶ11B.4.5恢复培养恢复培养时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次。Ⅶ12附录C沙土管保藏法C.1适用范围本方法适用于产孢类放线菌、芽孢杆菌、曲霉属、青霉属以及少数酵母如隐球酵母和红酵母等。不适用于病原性真菌的保藏，特别是不适于以菌丝发育为主的真菌的保藏。C.2原理干燥条件下微生物菌种代谢活动减缓，繁殖速度受到抑制。此方法可减少菌株突变，延长存活时间。C.3方法与步骤C.3.1沙土管制备将河沙用60目过筛，弃去大颗粒及杂质，再用80目过筛，去掉细沙。用吸铁石吸去铁质，放入容器中用10%盐酸浸泡，如河沙中有机物较多可用20%盐酸浸泡。24小时后倒去盐酸，用水洗泡数次至中性，将沙子烘干或晒干。另取瘦红土100目过筛,水洗至中性，烘干，按沙∶土=2∶1混合。把混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中，高度为1厘米左右。塞好棉塞，0.1MPa灭菌30分钟，或常压间歇灭菌3次，每天每次1小时。灭菌后在不同部位抽出若干管，分别加营养肉汁、麦芽汁、豆芽汁等培养基，经培养检查后无微生物生长方可使用。C.3.2斜面培养物的制备参照附录A。C.3.3制备菌悬液向培养好的斜面培养物中注入3mL-5mL无菌水，洗下细胞或孢子制成菌悬液。用无菌吸管吸取菌悬液，均匀滴入沙土管中，每管0.2mL-0.5mL。放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。C.3.4干燥用真空泵抽去安瓿管中水分并放置于干燥器内。C.3.5纯培养检查Ⅶ13从做好的沙土管中，按10∶1比例抽查。无菌条件下用接种环取出少量沙土粒，接种于适宜的固体培养基上，培养后观察其生长情况和有无杂菌生长。如出现杂菌或菌落数很少，或根本不长，则须进一步抽样检查。C.3.6保藏将纯培养检查合格的沙土管用火焰熔封管口。制好的沙土管存放于低温(4℃-15℃)干燥处，半年检查一次活力及杂菌情况。也可将纯培养检查合格的沙土管直接用牛皮纸或塑料纸包好，置干燥器内保存。用此方法保藏时间为2-10年不等。C.3.7复活复活时在无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次，也可取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面。Ⅶ14参考文献[1]中国科学院微生物研究所.菌种保藏手册[M].北京：科学出版社，1980[2]杜连祥.工业微生物学实验技术[M].天津：天津科学技术出版社，1992[3]诸葛健，王正祥.工业微生物实验技术手册[M].北京：中国轻工业出版社，1994[4]杜连祥.乳酸菌及其发酵制品生产技术[M].天津：天津科学技术出版社，1999[5]姜成林，徐丽华.微生物资源学[M].北京：科学出版社，1997