搜索
一、色谱技术回顾色谱的起源(色谱法是什么？)色谱法最早出现，是俄国植物学家Tswett于1903年在波兰华沙大学研究植物的叶子组成时，用碳酸钙作为吸附剂，分离植物干燥叶子的石油醚萃取物；植物的色素吸附在管内的碳酸钙里，再用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素，于是管内的碳酸钙上形成了三种颜色的6个色带。当时，Tswett把这种色带叫做“色谱”，其英文译名为Chromatography。这一方法中的碳酸钙成为“固定相”，而纯净的石油醚被称为“流动相”。Tswett的方法就成为液固色谱（Liquid－SolidChromatography）。TewettM,BerDtschBotGes,1906;24:316.内容一、色谱技术回顾二、高效液相色谱法及色谱基本语言三、培训设备四、溶剂准备五、LC3000色谱仪组成六、LC3000系统基本操作七、HPLC维护知识色谱技术回顾色谱法的原理图形化解释色谱法100米短跑8位选手位于起跑线上开始：(样品溶液在进样阀))跑道阻力,空气阻力：（色谱柱）肌肉动力:（输液泵）拍照和终点线：(检测器)秒表：（工作站)色谱分离的机理★★色谱分离是一个物理的过程流动相（MobilePhase）固定相（StationaryPhase）样品（溶解于流动相中的溶质）色谱技术回顾色谱技术回顾色谱法是什么？色谱法是利用不同性质的物质在不相混溶的两相中分配系数，吸附解吸附或其它性能不同而被分离。色谱技术回顾常规分类方法按流动相的物态分:–气相色谱(GasChromatography,GC)用气体作为流动相(又叫载气)–液相色谱(LiquidChromatography,LC)用液体作为流动相(又叫洗脱剂)-超临界流体色谱（是指使用条件，超过了流动相的临界温度和压力，以CO2为代表）按固定相的形态分:–平面色谱纸色谱薄层色谱–柱色谱按流动相和固定相的相对极性分:–正相色谱(NormalPhaseChromatography)固定相的极性大于流动相–反相色谱(ReversedPhaseChromatography)固定相的极性小于流动相反相色谱最常用的流动相及其洗脱强度：水甲醇乙腈乙醇丙醇异丙醇四氢呋喃最常用的流动相组成“甲醇-水；乙腈-水”正相色谱最常用的流动相及其洗脱强度：正己烷乙醚乙酸乙酯异丙醇**应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法色谱技术回顾按分离过程的机理分:–吸附色谱(AbsorptionChromatography)•根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离–分配色谱(PartitionChromatography)•分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同–离子交换色谱(IonExchangeChromatography)•根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱(IC)–体积排除色谱(SizeExclusionChromatography)•GPC(GelPermeationChromatography)凝胶渗透色谱法––固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂•GFC(GelFiltrationChromatography)凝胶过滤色谱法––固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液什么是高效液相色谱HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色谱法，简称：HPLC是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段：高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器……广泛应用于各个领域：医药/环保/石化/生命科学/食品及农业……二、高效液相色谱高效液相色谱法柱色谱法色谱柱长度（cm）10～2510～200固定相粒度：粒度（um）筛孔（目）5～502500～30075～600200～30色谱柱入口压力（MPa）2～200.01～0.1色谱柱柱效（理论塔板数/米）2000～500002～50分析时间（h）0.05～1.01～20与经典液相色谱（柱色谱）比较高效液相色谱色谱图：HPLC图形结果（Chromatogram）←色谱峰保留时间（分）基线↓峰高峰宽色谱图液相色谱图相关术语峰高－PeakHeight峰最大值到峰底的距离半（高）峰宽－PeakWidthatHalfHeight通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离峰面积－PeakArea峰与峰底之间的面积,又称响应值液相色谱图相关术语基线－Baseline在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线基线飘移－BaselineDrift基线随时间定向的缓慢变化基线噪声－BaselineNoise由各种因素所引起的基线波动液相色谱图相关术语死体积，V0－Deadvolume不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积保留体积，VR－Retentionvolume组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积死时间，t0－Deadtime不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间保留时间，tR－Retentiontime组分从进样到出现峰最大值所需的时间柱效–色谱柱的分离效率理论塔板数–用于定量表示柱效，假设一根柱子可以分为N段，在每段内组分在两相间很快达到平衡，把每一段称为一块理论塔板。设柱长为L，理论塔板高度为H，则H=L/N，式中N为理论塔板数。★★经验计算公式：N=L/2d(d为填料的直径)理论塔板数N与柱长有关，当比较两不同长度的色谱柱的柱效时，应当比较它们在相同柱长下的N值。液相色谱相关术语液相色谱相关术语拖尾因子–Tailingfactor,Tf峰高5%处的峰宽与峰极大到前伸沿之间二倍距离之比Tf=(A+B)/2A不对称因子-Asymmetry,As峰高10%处的前沿峰宽比后沿峰宽As=A/B柱效测试参考方法条件（Φ100*250mm制备柱）：流速：150--250mL/min流动相：CH3OH（90%CH3OH-H2O）进样体积：1-2mL检测波长：254nm样品名称：苯、甲苯、萘、蒽样品浓度：1mg/ml(1ml/100ml)环境温度；柱压；柱效；拖尾因子柱效图谱分离度-简单说来,分离度即是两峰相对于其峰宽分开得有多远液相色谱相关术语液相色谱方法开发液相色谱实验所需的基本参数流动相：种类及配比，等度或梯度固定相：色谱柱类型及内径、长短流动相输送系统参数：流速检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等温度控制进样量以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称色谱条件线性色谱与非线性色谱比较线性色谱的特点有三：保留行为（时间，体积）只与样品本身有关，与浓度无关。峰高或峰面积与浓度成比例，在线性范围里色谱峰是高斯峰，对称分布非线性色谱的特点也有三：一．色谱峰保留行为（时间，体积）不仅与样品本身有关，还与浓度无关。二．峰高或峰面积与浓度不成比例。三．色谱峰是不对称的三、培训设备二、培训设备CXTHLC3000色谱仪P3000高压输液泵UV3000紫外检测器7725i手动进样阀T2000柱温箱（可选）C18色谱柱250×4.65u（可选）其它色谱基本条件（流动相准备、电脑和实验台等）四、溶剂准备1、条件：色谱级纯或者优级纯甲醇或者乙腈（ACN）、二次蒸馏水2、流动相的过滤和超声3、样品的前处理和过滤五、LC3000色谱仪组成1、P3000泵一元（等度）系统两元（梯度）系统基本操作泵的基本操作可以通过CXTH-3000工作站（推荐使用）或者泵仪器面板控制。以下是泵面板的基本控制按钮PUMP/STOP键：按一下该按键可以运行泵，再按一下停止泵运行。START/HOLD键：按一下该键运行预先设定的程序链（PROGRAM）。再按一下保持此时的程序运行PURGE键：冲洗键。按一次泵按照（SYSTEMSETING）系统设定中设定冲洗流量运行冲洗。再按一次泵停止冲洗。作用：冲洗泵头气泡和快速更换流动相。DEL键：退出键或者删除键。进入子菜单下通过此键退回上一菜单。ENTER键：进入键或者确认键。按该键进入子菜单。方向键：光标的上下左右移动。常见问题（泵的密封垫）泵的密封垫是最易损耗的部件，密封垫的损坏会引起系统的多种故障，渗漏和垫圈碎片会污染系统。密封垫磨损是不能避免的，一定的保养会延长其寿命。1每天使用完毕后将泵头中的缓冲盐置换掉。2使用色谱级流动相3贮液瓶中加装入液管口过滤器4保持仪器在较低压力下运行常见问题（单向阀）单向阀失灵：球与阀座密封不严，造成液流倒流压力不稳，或者球与阀座粘在一起阻死。密封不严是污染或者气泡引起的，球与阀座粘在一起是由于污染或者磨损造成的。可取出单向阀放入甲醇、乙腈、稀硝酸内超声15min，再反复用甲醇、水冲洗数次。泵参数P3000A型高压输液泵流量范围：分析型0.001-9.999mL/min半制备型0.01-49.99mL/min流量精确度：±0.5%(1mL/min)流量准确度：RSD≦0.1%(1mL/min)P6000制备型高压输液泵流量范围：1-1000mL/min（依不同配置有所变化）流量精确度：±1%流量准确度：RSD≦0.5%P6000-3L型高压输液泵流量范围：1-3000mL/min流量精确度：±1%流量准确度：RSD≦0.5%、UV3000检测器工作原理是基于光的吸收定律朗伯-比耳定律。该定律指出，当一束单色光辐射通过物质溶液时，如果溶剂不吸收光，则溶液的吸光度与吸光物质的浓度和光经过溶液的距离成正比。－Vis检测器的原理：UV检测器是一种光吸收型检测器。它主要基于朗伯－比尔定律：A＝log（I0/I）=logI0-logI=ε×L×C其中：A－吸光度I0－入射光强度I－透射光强度ε－摩尔吸光系数L－流通池的光程C－样品浓度