NPY在实验大鼠垂体腺瘤中的表达及意义111

神经肽Y及其受体在实验性大鼠垂体腺瘤中的表达陈来照马景鑑【摘要】目的研究神经肽Y及其受体在实验大鼠垂体腺瘤中的表达，探索NPY在垂体腺瘤形成过程中的作用。方法雌性Wistar大鼠40只，通过腹腔注射雌激素的方法建立大鼠垂体腺瘤模型，在此基础上采用放射免疫法测定大鼠血浆NPY的浓度，应用免疫组化、免疫电镜和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的方法分别研究大鼠垂体中NPY及其受体的表达。结果（1）实验组大鼠垂体符合垂体腺瘤的诊断标准；（2）免疫组化和RT-PCR研究表明，在实验组大鼠垂体腺瘤中NPY及其Y1R和Y2R的基因表达水平明显低于对照组垂体。（3）免疫电镜显示NPY阳性颗粒主要位于腺垂体细胞的内分泌颗粒中。结论通过雌激素诱导Wistar大鼠，可以成功建立垂体腺瘤动物模型；实验组大鼠垂体腺瘤中NPY及其受体的表达下调可能与肿瘤的发生有关。【关键词】大鼠；垂体腺瘤；神经肽Y；受体。ExpressionofneuropeptideY(NPY)aswellasitsreceptorsinestrogen-inducedpituitaryadenomainratsCHENLai-zhao﹡,MAJing-jian.﹡DepartmentofNeurosurgery,Firsthospital，ShanXiMedicalUniversity,TanYuan030001,China。【Abstract】ObjectiveTheaimofthisstudywastoexploretheexpressionofneuropeptideYaswellasitsreceptorsinestrogen-inducedpituitarytumorsofWistarrats,toinvestigatetheirrolesinpituitarytumorigenesis.Methods40femaleWistarratsweredividedrandomlyintoexperimentalandcontrolgroups.Theratswereinducedwithestradiolbenzoatebyperitonealinjectioninexperimentalgroup.TheexpressionofNPYaswellasitsreceptorsinpituitaryglandswasalsodetectedbyimmunohistochemicalanalysisandsemi-quantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR).Somepituitarytissueswerealsoexaminedusingimmuno-electronmicroscopyinordertostudythedistributionofNPYatthesubcellarlevel.Results(1)Inexperimentalgroup,significantincreasesinpituitaryweightwerenotedthreemonthsafterperitonealinjectionofestrogen.Theserumprolactin基金项目：国家自然科学基金资助项目（30471772）作者单位：030001太原，山西医科大学第一医院神经外科（陈来照），天津医科大学总医院神经外科（马景鑑）通讯作者：陈来照(E-mail：[e-mail])concentrationalsoincreasedsharply.(2)TheexpressionlevelofNPYinpituitaryofexperimentalgroupsweresignificantlylowercomparedtothatofcontrolgroup(P0.001).RT-PCRdetectionalsoindicatedthatthegeneexpressionofY1andY2receporsweredecreasedinthepituitarytumors(P0.001).(3)Immuno-electronmicroscopyexaminationdemonstratedthatpositiveNPYstainingwithahighdensityofgoldparticleslocatedmainlyinthesecretorygranulas.ConclusionThesedatasuggestthatchronictreatmentwithestrogencanresultinpituitaryadenomainfemaleWistarrats.EexpressionofNPYaswellasitsreceptors(Y1RandY2R)wasdecreasedbyestrogeninthepituitaryglands,withpossibleinvolvementinestrogeninducedpituitarytumorigenesisinrats.【Keywords】Ratpituitaryadenomamodel;NeuropeptideY;Receptor;垂体瘤发病机制十分复杂，目前认为垂体瘤发生是多种因素共同参与的病理过程。NPY是重要的神经内分泌调节因子之一，不仅广泛存在于下丘脑，而且垂体中也发现有NPY及其受体的表达。NPY对垂体内分泌活动具有重要的调节作用，但NPY在垂体腺瘤中表达的相关研究十分少见，国内尚未见类似的报道。本研究采用雌激素诱导法建立大鼠垂体腺瘤动物模型，通过免疫组织化学、免疫电镜以及逆转录聚合酶链反应技术研究垂体腺瘤中NPY及其受体的表达，揭示NPY在大鼠垂体腺瘤形成过程中的作用。材料与方法1．建立动物模型的方法：4周龄Wistar雌性大鼠40只，体重80～100g。动物随机分为实验组和对照组，每组20只。摘除大鼠的双侧卵巢，2周后开始诱导，给药途径为腹腔注射，实验组用苯甲酸雌二醇，对照组用芝麻油，0.5ml/每次，隔日一次。动物饲养环境室温22℃，光照时间12小时/日，大鼠可以随意获取水和食物，诱导时间12周。2．动物标本采集：12周后经腹腔注射戊巴比妥麻醉，取血2ml，用于血清泌乳素(PRL)浓度测定，方法为放射免疫法。取出垂体，称重后等分，一份快速置入液氮中冷冻，后存于－70℃冰箱，用于NPY及其受体基因表达的研究；另一份用4％多聚甲醛固定，用于组织病理检查。3.垂体组织NPY免疫组化和免疫电镜：Ⅰ抗为兔抗鼠NPY抗体；Ⅱ抗为即用型SABC试剂盒－SA1022；DAB显色试剂盒－AR1022。PBS代替一抗作阴性对照。具体操作流程按照试剂说明。随机选取实验组垂体腺瘤和对照组垂体各2例进行免疫电镜研究，采用低温包埋技术，Ⅰ抗同免疫组化，Ⅱ抗为胶体金偶联的羊抗兔IgG，胶体金直径10nm，JEM-100CXII透射电镜观察。4．垂体组织NPYRT-PCR半定量测定：应用PrimerExpress软件设计NPY、Y1R、Y2R和β-actin特异性引物。所有引物经BlastSequenceSimilaritySearch对比，表明与其它基因无交叉，各引物见表1。提取组织总RNA的，测定RNA质量。分别按照RT和PCR试剂说明进行RT和PCR反应，PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳，以β-actin作为对照，对扩增产物进行半定量分析。表1PCR引物序列及扩增片断长度基因名称引物序列（primer）产物长度(bp)GeneBankNumberNPY上游：TGGACTGACCCTCGCTCTA下游：GGGACAGGCAGACTGGTT348NM012614Y1R上游：GCTTCTTCTCTGCCCTTCGTG下游：AGTCTCGTAGTCGTCGTCTCG546Z11504Y2R上游：CTTTGAGATTGTAGCCTGTACTGA下游：GCCAGCTGACTGCAAACACCACTA254NM023968β-actin上游：CCATCATGAAGTGTGACGTTG下游：ACAGAGTACTTGCGCTCAGGA175BC0631665．统计方法应用SPSS11.5统计软件对实验数据进行分析处理，采用独立样本t检验和Mann-whitney检验对两组数据进行分析比较。结果1．大鼠垂体和血清PRL浓度的改变：两组大鼠离体垂体标本见图1，实验组大鼠垂体体积明显增大，两组垂体重量见表2。组织切片显示：对照组垂形态结构正常，见图2。实验组垂体体积增大，细胞排列紊乱，瘤细胞形态多样，大小各异，核有异形性，核深染，结构不清，可见红细胞溢出现象，见图3。两组大鼠血清PRL浓度见表2。实验组大鼠血清PRL浓度大约是对照组大鼠4倍，P0.01，差异有统计学意义。图1实验和对照组大鼠离体垂体标本。C：对照组垂体；E：实验组垂体。图2对照组垂体前叶：可见排列成团状和条索状的腺细胞以及窦样毛细血管。HE×400图3实验组垂体腺瘤：瘤细胞形态多样，大小不一，细胞核有异型性，可见核仁。HE×400表2两组大鼠垂体重量、血清PRL和垂体中NPY及其受体基因表达比较（x±s）分组例数垂体重量（mg）血清PRL（ng/ml）NPYmRNAY1RmRNAY2RmRNA实验组2052.35±4.97198.23±93.070.48±0.200.42±0.210.47±0.12对照组2012.02±0.7750.12±14.241.10±0.210.58±0.191.28±0.46t值29.987.0357.452.677.57P值0.0000.0000.0000.0110.0002．NPY在大鼠垂体中蛋白水平的表达在实验组垂体腺瘤和对照组垂体中，NPY染色以胞浆着色为主，部分胞核也呈阳性，NPY免疫组化半定量分析结果见表3。统计结果表明，实验组垂体腺瘤中NPY表达水平明显低于对照组腺垂体，差异具有统计学意义，P0.001。免疫电镜显示，实验组垂体腺瘤细胞中粗面内质网丰富，且轻度扩张，同时可见密集的内分泌颗粒，电子密度高而均匀。NPY标记呈阳性的胶体金颗粒主要位于细胞的内分泌颗粒中，见图4。对照组垂体前叶细胞内同样可见阳性胶体金颗粒，但密度明显高于实验组垂体腺瘤。图4实验组垂体腺瘤。NPY免疫电镜显示，胶体金颗粒主要位于肿瘤细胞的分泌颗粒内。（免疫电镜×40,000）。表3实验组和对照组垂体NPY免疫组化的半定量分析结果分组例数NPY表达uP－＋＋＋＋＋＋实验组20119004.320.000对照组20071213NPY及其受体在实验组垂体腺瘤和对照组垂体基因水平的表达RT-PCR半定量分析显示，实验组垂体腺瘤中NPY及其受体（Y1R和Y2R）的基因表达低于对照组，见图5，6和表2，两者差异有统计学意义（P0.05）。图5实验组垂体腺瘤和对照组垂体中NPY及其受体基因表达电泳图。M:marker,Lane1:对照组NPY,Lane2:对照组Y1R,Lane3:对照组Y2R,Lane4:实验组NPY,Lane5:实验组Y1R,Lane6:实验组Y2R。00.511.52NPYY1RY2RNPY及其受体基因表达水平实验组对照组图6NPY及其受体在实验组垂体腺瘤和对照组垂体中表达。﹡差异有统计学意义（P05）讨论神经肽由36个氨基酸组成，在动物的下丘脑和垂体门脉系统中含量丰富，对神经内分泌活动具有重要的调节作用。有报道认为在腺垂体和垂体腺瘤中也存在NPY表达[1]，表明NPY不但影响正常垂体的内分泌活动，而且还可能参与垂体腺瘤的调节。本实验选用4周龄Wister大鼠，通过腹腔注射苯甲酸雌二醇建立垂体腺瘤动物模型。无论从垂体重量和血清PRL浓度方面[2]，还是组织形态方面，均证实经雌激素诱导可成功获得垂体瘤模型。在此基础上应用免疫组化、免疫电镜以及RT-PCR技术，研究NPY及其受体在实验性大鼠垂体腺瘤中表达特点，揭示NPY对垂体腺