微生物转化

微生物转化•UM-BBD•第一章微生物转化方法•从20世纪50年代开始，微生物学家通过有机化学、物理学、生物化学和遗传基因学等学科的帮助，来研究了微生物代谢产物中的化学组成以及生命活动中酶和酶的化学反应使生物学科向分子水平发展；同时也提供了微生物学向化学学科的渗透。微生物学研究者应用现代的生物技术来帮助生物化学和有机化学工作者解决一些复杂和疑难的微生物代谢产物和化学合成的反应．创造出不少人工合成的新化合物，推动了生物化学和有机化学的发展。••微生物转化是通过微生物细胞将复杂的底物进行结构修饰，也就是利用微生物谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物特定部位(基团)进行的催化反应。•微生物作为一个生命体，其体积虽小，但有一套自身特异性的酶体系。在它的生长过程中有无数酶的参与，合成酶、水解酶、异构酶、氧化酶、还原酶等都可能对加入其中的底物发生作用，使其结构发生变化。•正因为微生物有着这独特的优点，微生物转化就具备了生物量积累快、转化时间短、转化酶表达效率高、便于工业化生产的特点。•微生物转化历史悠久，早在2500年前的春秋战国时期，人们就已经知道制酱和醋。在宋代，采用老的曲子进行接种，还根据酸大米和明矾水在较高温下培养制造红曲。不过当时人们并没有认识到可以利用微生物来合成化学物质。•因此一般认为微生物转化研究始于1864年巴斯德利用乙酸杆菌将乙醇氧化为乙酸，但工业化微生物转化的重要里程碑应该是20世纪50年代美国普强药厂的Murray和Peterson利用微生物黑根霉(Rhizonpusnigricans)的羟化酶将黄体酮转化为11α-羟基黄体酮，即对甾体化合物的结构改造。•利用微生物的作用来进行某种化学反应称为微生物转化反应(microbialtransformationormicrobialbioconversion)。•准确地说应该是利用微生物代谢过程中某一个酶或者一组酶系对底物进行催化反应称为微生物转化反应。•随着生物学科进一步发展，特别是固定化细胞、诱变和基因重组等重要的生物技术的发展，不仅使得生物转化成倍地提高转化率，并且能将几种不同合成基因构建到同一个工程菌中使得一次培养同时进行几步转化反应，使微生物转化在天然药物修饰中发挥更重要的作用。第一节微生物转化的反应•随着现代生物技术的不断进步，特别是固定化细胞、诱变和基因重组等的发展，使微生物转化的转化率成倍提高，也为天然药物结构修饰带来了广大的发展空间。•不同类的微生物都含有不同的酶系。现在将目前应用和研究上用得比较多的微生物按化学反应分类。1．应用于氧化反应•(1)脱氢反应应用于脱氢反应的主要是细菌(2)羟基化反应应用于羟基化反府的主要是放线菌2、应用于水解反应•应用于水解反应的主要是细菌、酵母菌和霉菌3、应用于还原反应•应用于还原反应的主要是酵母菌和霉菌。4、应用于酰基化反应•应用于酰基化反应的主要是细菌5、应用于降解反应•应用于降解反应的主要是细菌6、应用于脱水反应•应用于脱水反应的主要是细菌和霉菌第二节微生物转化的一般过程•微生物转化实验概要过程如下：选择需要的菌株培养成熟菌丝或孢子选择合适的转化方式转化培养或转化菌丝及孢子悬浮液转化转化液的分离提取产品纯化1．选择菌种•选择好的菌种是做好微生物转化反应的关键；根据微生物转化反应的类型，选择哪类微生物含这类反应的酶。一般可以向国家或地方保管菌种机构去函索取。2.制备培养基•按微生物转化菌种的培养特征和转化反应需要配制培养基；一般要求培养基的成分能使菌丝生长丰满和富含需要的酶。3加转他底物•加底物时有两个同等重要的影响因素：选择合适的菌种生长期加底物；选择加底物的方法和方式。4添加刺激剂或抑制剂•添加抑制剂是抑制酶副反应或抑制其他反应不良酶的生长；添加刺激剂是提高酶活力和增加酶生长量。5控制好转化反应培养时间•按有关微生物转化反应各种因素，控制好转化反应培养终点电，使底物转化达到最大反应完全值。6调控好影响因素•调控好整个转化过程中各项影响因素。7控制好转化反应终点•当取样分析反映转化培养液中转化产物积累不再增加时，立刻采用物理方法将菌丝体及培养物除去来停止转化反应。8分离纯化转化产物•此时转化产物已与生物转化系统分开，可按化学方法将产物分离提纯第三节几种常用的微生物转化方法•随着固定化细胞、诱变和基因重组等重要的生物技术的发展，不仅使得微生物转化在天然药物修饰中发挥更重要的作用，使生物转化成倍地提高转化率，并且使得微生物转化方法更加丰富。现在将几种微生物转化方法简介如下。1、分批培养转化法•分批培养(batchculture)转化法是在摇瓶和发酵罐中待菌体生长到一定阶段加入底物进行转化的方法。•底物加入时间因菌种和底物不同而各异，一般在对数生长期，但也有在延迟期和稳定期加入的。2、利用酶进行生物转化•直接从微生物体内或发酵液中将酶提出．在体外对底物进行生物催化。•可以经过多步处理得到纯度较高的酶。也可以是粗酶。•现在微生物来源的酶已广泛应用于食品、医药、化工及环保等行业3、应用渗透细胞进行生物转化•应用渗透细胞进行生物转化主要是促进底物渗入胞内，与酶充分接触，同时便于转化产物透出胞外，这种方法更适合于胞内酶作用的生物转化。•增大细胞渗透性或改变细胞膜孔，一般采用表面活性剂或有机溶剂，有时也可利用抗生素来增加细胞膜的渗透性，但用量应适当控制，以免杀死微生物。4、应用孢子进行生物转化•细菌的孢子一般无活性，而真菌的分生孢子和子囊孢子往往有较高的酶活力，与菌丝体比较具有杂质相对少的优点。•孢子转化需要注意的是不能让孢子萌芽，否则不能保持稳定的生物转化活力。•应用于生物转化的孢子悬浮液和培养基成分与静止细胞转化法相似．也是采用不完全培养基，仅含有缓冲液及葡萄糖等产生能量的碳源。5、应用固定化细胞进行生物转化•固定化细胞在适宜的转化条件下进行生物转化能保持细胞相对活的状态，它的最大优点是可以长期反复使用，有的能维持有效催化达数月之久。•另外使用固定化细胞还使得产物提取简单，便于自动化和大规模的工业化生产。•目前常用的固定化方法有聚丙烯酰胺聚合法和卡拉胶包埋法。6、应用干燥细胞进行生物转化•干燥细胞转化法实际上是另一种静息细胞转化法，便于贮备随时使用。干燥细胞的制备有以下两种常用方法。•①冰冻干燥法：将培养好的菌丝液，通过离心或过滤，洗涤后获得干净的菌丝体并重新悬浮于稀的缓冲液或纯水中，冰冻后抽真空，直接升华除去水分．得到蓬松的粉末。这种干燥菌丝体在冰冻保存的条件下可以保持活力达数年之久，适合于大规模的工业化生产。•②丙酮干粉制备法：•将菌丝体悬浮于一20℃的丙酮中处理3次，每次获得泥浆状的丙酮液，用抽气过滤进行收集，最后用冷乙醚洗涤，以帮助洗去残余的丙酮。•丙酮干粉剂必须冰冻贮藏，以供随时使用。7静息细胞转化法•静息细胞转化法是指将微生物培养至～定阶段后分离出菌丝体，将其重新悬浮于不完全培养基(缺少某种营养物质，如氮源等)中，使其处于不再生长但仍保持原有各种酶活的状态，再加入底物，在适当的温度、pH和振荡条件下进行转化的方法。•它是一种将生长影响减至最小的生物转化方法。第四节微生物转化反应的特点•微生物转化反应，可以用静止地按洗涤细胞进行研究．也可以用发酵方式进行转化以及应用固定化细胞进行生产等。•它跟酶法转化和有机化学转化比较有以下特点1、反应条件温和、公害少、设备简单且反应速度快•①在微生物转化的反应中一般无需高压、强热等比较苛刻的条件，只需在常温和pH为7左右的环境下进行反应即可；•②原料除了普通的培养基和底物外没有其他化学品，一般普遍认为公害比较少；•③设备简单，反应条件比较温和，生产安全。•④微生物转化反应是酶催化的反应。在最合适条件下，一秒内酶能催化底物转化成产物的分子个数数量级是102～lO62、可以减少反应步骤•随着现代生物技术的迅速发展，酶合成基因构建的基因工程菌可以把需要几步催化合成的中间体在一次发酵中转化完成。•将几步中间体合成的酶通过基因构建到同一工程菌中，使在发酵法转化时需要几步催化台成的中间体只要一步就可以转化成功。•如维生素c生物合成中基因重组葡萄糖酸氧化杆菌的代谢工程菌，将L-山梨醇脱氢酶基因和L-山梨酮脱氢酶基因，通过基因重组构建出一个工程菌株，发酵过程可以在同一次转化发酵中将D一山梨醇转化成α一酮一L古洛糖酸。3、对立体结构合成上具有高度的专一选择性•微生物转化反应其实也是一种酶反应．对底物作用时，具有高度的立讳一构选择性。•微生物转化反应不仅对结构有化学选择性，还有区域选择性、面选择性和对映异构选择性。•严格的立体结构选择性对天然药物微生物转化来说是非常重要的。•因为药物的异构不仅无用或者低效，并且会带来副作用，有时会有相反的药效和强力的毒性。•特别是生理活性很高的激素、抗生素以及心血管系统和神经系统等药物的药效对对映体结构的要求很高，往往具有严格对映体结构要求，这是有机化学合成等方法根难达到的。4、回收率高、成本低•微生物转化反应是在细胞内进行，保持原来整体酶系比较符合生物催化所需环境和条件。•在氧化一还原等催化反应时不需要添加辅酶；辅酶往往很不稳定，难以分离提取，从这点来说微生物转化比酶法转化要好多了。•微生物反应可以持续进行、反应量大、回收率高并可以大规模工业化生产。从设备和原料方面来说生产成本低于酶法和化学合成法第二章微生物转化的影响因素•利用微生物代谢过程中某一个酶或一组酶系对底物进行催化反应，称为微生物转化反应。•微生物转化反应本质上是一个酶反应，因此，同酶反应一样，在这个催化反应过程中涉及一系列的影响因素，其中最为重要的是转化的时间、温度、底物添加方法、酶的抑制剂、酶的诱导剂以及生长调节剂等。•上述因素的变化皆会对转化率有一定的影响。下面分别针对上述因素对微生物转化的影响加以具体叙述一、转化的时间和温度•微生物转化反应本质上是酶反应，是单酶或多酶的催化反应。•既然是酶反应，就存在一个最佳的反应时间，时间太短则转化不完全；时间太长，会造成微生物衰亡及酶失活。•最佳反应时间的确定可以采用高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、薄层扫描(TLCS)、分光光度法等定量分析手段来完成。•不同的反应类型、不同的微生物、不同的酶，最佳反应时间不同，有的只需几小时，有的则持续数天•温度也是影响转化率的一个重要因素。•温度升高，转化率会提高，但超过一定的限度，会使得酶失活速率也加快，所以只有在一个适当的温度下转化，才能达到最佳转化率。•最佳温度的选择也可通过上述分析检测手段来确定二、底物添加方法•在微生物转化中，根据能否溶于水来分，可以把底物分为两大类，即可溶于水和不可溶于水底物。•能溶于水的底物添加方法中有许多是与培养基中添加碳源的方法相类似，但是其转化率与其添加方法有很大的影响。•对于能溶于水的底物来说，将其添加到水的培养基中进行微生物转化是比较容易的，不过要注意加底物量的多少、添加速度和底物是否对微生物有毒性。•添加底物的量一般与微生物转化反应的类型，细胞内含酶的多、少、强、弱和底物的化学性质有关；•含酶活力强和含酶量多的微生物进行转化时，添加底物的速度可以快点，底物的量也可以多点。•加底物速度和量要与微生物的耐受能力相挂钩，底物舔加的速度和总量不能超过微生物的耐受范围，•同时产物的积累也会对酶产生抑制，所以必须有一个合适的底物添加量，一般来说，非离子化合物的底物最大投料质量浓度约为10％，而离子型的底物为5％；不同的微生物对有毒性的底物的耐受性不一致，一般来说在微生物生长期其耐受有毒底物的能力比较低；还得注意的一点是即使对没有毒性的底物，当转化积累到大量的非毒性底物时，也会产生产物抑制现象，所以最好用连续培养发酵随时分离转化得到的产物。•而对于不能溶于水的底物来说，将其添加到水的培养基中要比添加能溶于水的底物难得多，但是随着现代化生物技术的广泛应用，目前已经有许多种解决方法了。•①采用将底物制成细粉末状的固体直接投料。•这种投料方式使得转化细胞和粉末底物之间有最好的接触表面积，转化率也会提高。•在甾体转化中常用此法