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微生物遗传育种实验-氨基酸营养缺陷型突变株的筛选一、目的要求•了解营养缺陷型突变株选育的原理。•学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法。二、基本原理•营养缺陷型是指野生型菌株由于某些物理因素或化学因素处理，使编码合成代谢途径中某些酶的基因突变，丧失了合成某些代谢产物(如氨基酸、核酸碱基、维生素)的能力，必须在基本培养基中补充该种营养成分，才能正常生长的一类突变株。这类菌株可以通过降低或消除末端产物浓度，在代谢控制中解除反馈抑制或阻遏，而使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物积累。在氨基酸、核苷酸生产中已广泛使用营养缺陷型菌株。三、实验材料•1）菌种：细菌1299•2）培养基：细菌完全培养基；细菌基本培养基无氮基本培养基；2倍氮源基本培养基3）仪器：台式离心机、恒温培养箱、电炉等四、实验步骤（一）培养基制备、细菌对数期培养1.配制培养基：每组的配量肉汤培养基：100ML取10ML分装2支小试管，包扎，灭菌。完全培养基：在剩余的90ML肉汤培养基中加入琼脂，装入三角瓶中，包扎，灭菌。无氮培养基：100ML取10ML分装2支大试管，包扎，灭菌。2倍氮培养基：在剩余的90ML无氮培养基中加入0.2%（NH4）2SO4，装入三角瓶中，包扎，灭菌。生理盐水：100ML注：配方见《微生物实验讲义》69页。•2.做对数期培养：取一支肉汤培养基，接入1299，于30度下培养24小时。（二）制备菌悬液、紫外线诱变1.离心洗涤菌体：将对数期培养的菌液，进行2500转/分离心5分，倒掉上清夜，加入5ML生理盐水振荡混匀后，再进行一次离心。2.配制菌液和诱变：•菌液：在离心后的菌体中加入生理盐水，振荡混匀后，倒入无菌平皿中，加入生理盐水，使总液量达到10ML。•诱变：在30厘米处，用15W紫外灯照射菌液40秒后，置于暗处2小时。•中间培养：取诱变后的菌液1ML，加入5ML肉汤培养基中，32度培养。（三）淘汰野生型菌株1.无氮、二倍氮培养：将菌液离心洗涤后，加入5ML无氮培养基中，饥饿培养2小时后，加入2氮培养基中再培养2小时，恢复野生型的生长。2.青霉素杀死野生型：加入200U/ML的青霉素1ML，于30度下培养。（四）涂CM平皿、培养突变型•1.倒CM平板：融化完全培养基，倒2个平板。•2.稀释和涂CM平皿：将培养液进行10-1、10-2稀释剃度，各吸取0.1ML分别接入2个平板，进行培养。（五）检出缺陷型•1.倒CM、MM平板：融化CM、MM培养基，各制备一个平板。在平板下贴好画有20个小格的纸。•2.用逐个检出法检测用牙签挑取20个长势良好的菌落，先接在MM培养基的一个位点上，再接CM培养基的相应位点上。32度培养48小时。（六）测定生长谱1.制备MM平板在培养皿底部划分5个区域，做好标记2.将可能是营养缺陷型的菌株，制备菌悬液，接种于平板上。3.在相应的区域加入不同的氨基酸组，进行培养。（七）鉴定缺陷型观察菌的生长情况，确定氨基酸缺陷型。组别1组氨酸苏氨酸谷氨酸天冬氨酸亮氨酸甘氨酸2346五、试验结论•得出结论，分析实验中遇到的问题。•进行考试。