微生物限度检查方法的验证

微生物限度检查方法的验证ygfyzy整理微生物限度检查方法的验证包括:1.细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证——准确性（回收率）2.控制菌检查法的验证——专属性3.实例一、细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证1.验证的目的：确认所采用的方法适合该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定。照此检查法和检验条件进行供试品细菌、霉菌、酵母菌数检查能保证检验结果的准确、可靠。2.验证的步骤：•根据样品特性，制定检验方法和检验条件。•保证验证试验所用的仪器、培养基和试剂等均符合试验要求。•按制定的方法进行试验。•根据验证结果，判断是否符合验证的标准。若符合,按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，应重新设立验证方案，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。3.验证用菌株：细菌计数验证用菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。霉菌、酵母菌计数验证用菌株：白色念珠菌、黑曲霉。第1页共21页微生物限度检查方法的验证ygfyzy整理菌株选择的原则:代表性,普遍性,低或非致病性,标准菌株(或该药品中常见的污染菌)。菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的方法保存。加菌量:50～100cfu。4.验证方法选择：平皿法（包括稀释法）、薄膜过滤法、中和法、离心沉淀法、联合方法。5.样品稀释级的选择：昀低稀释级，1g或1ml。6.培养基：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、改良马丁培养基、营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基。7.菌液制备(1)接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤中，35～37℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml。(2)接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml。(3)接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加3～5ml0.9％无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，取1ml菌液加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6，使菌数约为50～100cfu/ml。8.供试品的处理：固体：10g供试品+稀释剂至100ml液体：10ml供试品+稀释剂至100ml抑菌性供试品可采用加中和剂、自然沉降、离心或薄膜过滤。第2页共21页微生物限度检查方法的验证ygfyzy整理•菌液组•供试品对照组•试验组•稀释剂对照组每一验证菌株均应进行上述试验（顺序）。8.1菌液组：测定所加的试验菌数。平皿法：取试验用的1ml菌液（约50～100cfu），分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。8.2供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。（和试验组采用同法）8.3试验组：平皿法：取试验可能用的昀低稀释级供试液1ml和50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。培养基稀释法（平皿法）：取试验可能用的昀低稀释级供试液1ml分别注入n个平皿，每个平皿再注入50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2份，按平皿法测定其菌落数。薄膜过滤法：取规定量试验可能用的昀低稀释级供试液，过滤，冲洗，应在昀后一次的冲洗液中加入50～100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。至少要一张膜。离心沉淀法：取规定量试验可能用的昀低稀释级供试液，如供试液含许多药渣，先以低速500r/min离心3～5min，取上清液，再以3000r/min第3页共21页微生物限度检查方法的验证ygfyzy整理离心10～30min，取下面1ml液体（A)，并用适当的稀释剂洗涤管底，将洗涤液与液体（A)一起采用平皿法或薄膜过滤法计数。8.4稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化，中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释剂替代供试品，加入试验菌，使昀终菌浓度为每1ml供试液含50～100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。9.结果判断指标试验组的菌回收率（≥70%）稀释剂对照组的菌回收率（≥70%）10.回收率计算：表1试验组回收率测定结果阳性菌实验次数菌液组菌落数试验组菌落数供试品对照组菌落数回收率％12大肠埃希菌312枯草芽孢杆菌312金黄色葡萄球菌312白色念珠菌3第4页共21页微生物限度检查方法的验证ygfyzy整理12黑曲霉菌3注：（试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数）回收率＝菌液组平均菌落数×100％表2稀释剂对照组回收率测定结果阳性菌实验次数菌液组菌落数稀释剂对照组菌落数回收率％12大肠埃希菌312枯草芽孢杆菌312金黄色葡萄球菌312白色念珠菌312黑曲霉菌3注：稀释剂对照组平均菌落数回收率＝菌液组平均菌落数×100％第5页共21页微生物限度检查方法的验证ygfyzy整理每一验证菌株均应进行上述试验。验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。验证细菌各平皿倾入营养琼脂培养基。验证霉菌、酵母菌各平皿倾入玫瑰红钠琼脂培养基。置规定温度培养48或72h,菌落计数。计算回收率。11.回收率测定举例11.1供试液不用特殊制备方法11.1.1常规法菌液组：1ml菌液/平皿，每株菌平行2个平皿（计算平均菌数：C)供试品对照组：昀低稀释级供试液1ml/平皿，平行2个平皿（计算供试液平均菌数：B）试验组：昀低稀释级供试液1ml+1ml菌液/平皿，平行2个平皿（计算供试液平均菌数：A）回收率=(A－B)÷C×100%11.1.2培养基稀释法（5个平皿）菌液组：1ml菌液/平皿，每株菌平行2个平皿（计算平均菌数：C)供试品对照组：昀低稀释级供试液1ml分别注5个平皿，0.2ml/平皿，平行2份，共10个平皿（计算0.2ml供试液平均菌数：B）试验组：昀低稀释级供试液0.2ml+1ml菌液/平皿，注5个平皿，平行2份（计算平均菌数：A)回收率=(A－B)÷C×100%培养基稀释法可以是1ml供试液注2个、5个或更多个平皿。但是更多的平皿由于操作繁琐易污染一般不做。第6页共21页微生物限度检查方法的验证ygfyzy整理11.2供试液需用特殊制备方法（如加中和剂或乳化剂等)11.2.1常规法菌液组：1ml菌液/平皿，每株菌平行2个平皿（计算平均菌数：C)供试品对照组：昀低稀释级供试液1ml/平皿，平行2个平皿（计算供试液平均菌数：B）试验组：昀低稀释级供试液1ml+1ml菌液/平皿，平行2个平皿（计算供试液平均菌数：A）稀释剂对照组：稀释剂+加中和剂或乳化剂+1ml菌液，平行2个平皿（计算供试液平均菌数：D）试验组回收率=(A－B)÷C×100%稀释剂对照组回收率=D÷C×100%11.2.2培养基稀释法（5个平皿）菌液组：1ml菌液/平皿，每株菌平行2个平皿（计算平均菌数：C)供试品对照组：昀低稀释级供试液1ml分别注5个平皿，0.2ml/平皿，平行2份，共10个平皿（计算0.2ml供试液平均菌数：B）试验组：昀低稀释级供试液0.2ml++加中和剂或乳化剂1ml菌液/平皿，平行2个平皿（计算平均菌数：A)试验组回收率=(A－B)÷C×100%稀释剂对照组：稀释剂+加中和剂或乳化剂+1ml菌液，平行2个平皿（稀释剂对照组与试验组同法操作）（计算平均菌数：D)稀释剂对照组回收率=D÷C×100%11.2.3供试液需用特殊制备方法（离心沉淀法）菌液组：1ml菌液/平皿，每株菌平行2个平皿（计算平均菌数：C)供试品对照组：昀低稀释级供试液10ml+离心，500rpm离心取上清，第7页共21页微生物限度检查方法的验证ygfyzy整理加稀释剂至10ml，取1ml注平皿，平行2个平皿（计算平均菌数：B)或3000rpm离心取沉淀，加稀释剂至10ml，取1ml注平皿，平行2个平皿（计算平均菌数：B)试验组：昀低稀释级供试液10ml+离心，500rpm离心取上清，加稀释剂至10ml，取1ml+1ml菌液/平皿，平行2个平皿（计算平均菌数：A)或3000rpm离心取沉淀，加稀释剂至10ml，取1ml+1ml菌液/平皿，平行2个平皿（计算平均菌数：A)试验组回收率=(A－B)÷C×100%稀释剂对照组：取与菌液组细菌浓度相同的稀释剂10ml，3000rpm离心取沉淀，加稀释剂至10ml，取1ml注平皿，平行2个平皿（计算平均菌数：D)（稀释剂对照组与试验组同法操作）稀释剂对照组回收率=D÷C×100%11.2.4试液需用特殊制备方法（薄膜过滤法）菌液组：1ml菌液/平皿，每株菌平行2个平皿（计算平均菌数：C)供试品对照组：含1g或1ml的供试液，过滤冲洗，至少1张膜（菌落计数：B)试验组：含1g或1ml的供试液，过滤冲洗，+1ml菌液，过滤，至少1张膜（菌落计数：A)稀释剂对照组：稀释剂+菌液，过滤冲洗，至少1张膜（菌落计数：D)过滤细菌的膜贴在预先倒好并预培养过的营养琼脂培养基平板上，菌面朝上。过滤霉菌酵母菌的膜贴在预先倒好并预培养过的玫瑰红钠琼脂培养基平平板上，菌面朝上。试验组回收率=(A－B)÷C×100%稀释剂对照组回收率=D÷C×100%第8页共21页微生物限度检查方法的验证ygfyzy整理11.3计数方法的确定细菌计数方法与霉菌和酵母菌计数方法可以不一致。细菌以各试验菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）的回收率均能达到70%以上的检测方法为准。霉菌和酵母菌以各试验菌（白色念珠菌、黑曲霉）的回收率均能达到70%以上的检测方法为准。11.4计数方法的验证——结果判断在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应均不低于70%。若试验组的菌回收率均不低于70%，则按此供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数能保证检验结果的准确、可靠。若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。二、控制菌检查法的验证1.试验菌株：按规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。1.1阴性对照菌株:选择原则，口服选用金黄色葡萄球菌，外用选用大肠埃希菌。1.2菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的方法保存。1.3加菌量:10～100cfu验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。第9页共21页微生物限度检查方法的验证ygfyzy整理1.3.1试验组：取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查.1.3.2阴性菌对照组：设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性，方法同试验组。2控制菌检查验证用菌株：大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌。2.1口服制剂2.1.1验证用菌株：大肠埃希菌大肠菌群沙门菌2.1.2阴性对照菌菌株：金黄色葡萄球菌2.1.3检查方法：大肠埃希菌按大肠埃希菌项下检查大肠菌群按大肠菌群项下检查沙门菌按沙门菌项下检查2.2外用制剂2.2.1验证用菌株：铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌生孢梭菌2.2.2阴性对照菌菌株：大肠埃希菌2.2.3检查方法：铜绿假单胞菌按铜绿假单胞菌项下检查金黄色葡萄球菌按金黄色葡萄球菌项下检查生孢梭菌按生孢梭菌项下检查3.验证方法选择：常规法、稀释法、薄膜过滤法、中和法、离心沉淀法、联合方法。4.供试品量：1g或1ml，沙门菌检查为10g。5.培养基：营养肉汤培养基、胆盐乳糖增菌液、MUG培养基、胆盐乳