P53蛋白的研究与发展综述

P53蛋白的研究与发展综述-1-P53蛋白的研究与发展综述学院药学院课程名称生物技术制药年级2010级制药工程组员刘巧曾琼英陆凤慧刘杨姚瑶指导教师胡昌华廖国建2013年5月22日P53蛋白的研究与发展综述-2-P53蛋白的研究与发展综述刘巧；曾琼英；刘杨；陆凤慧；姚瑶西南大学药学院重庆400716【摘要】P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高，研究最透彻，功能最强大的一种抑癌基因。随着对其研究的深入发展,涉及的内容和应用范围越来越广泛。本文综合概述了P53基因的结构、性质、应用、发展历史，以及上市药物和在研药物，并详细介绍了典型重组P53药物——今又生。【Abstract】P53geneisatumorsuppressorgene.itcanbeactivewithmostofthecancercell.Thisarticleprovidesacomprehensiveoverviewofit’sstructure,character,application,developmenthistoryoftheP53gene,aswellasmarketeddrugsandinvestigationaldrugs,andgavedetailsofthetypicalrestructuringP53drugs——Gendicine.【关键词】P53基因；抗癌；应用；今又生1前言仅从90年代至今，关于p53作为肿瘤抑制因子的研究报道就有多于20000篇，是什么让p53得到科学界如此多的关注？在1979年，p53首次被发现。在上世纪80年代，TP53（p53的编码基因）被认为是一个原癌基因（proto-oncogene），直到90年代早期，TP53被广泛认为是一个肿瘤抑制基因，它处在细胞各种胁迫反应途径的十字路口上。p53在细胞周期捕获，DNA修复，细胞衰老、分化、调亡等过程中都起着重要的作用，它能修复损伤细胞，或者除去严重损伤的细胞从而避免这些细胞对机体的危害作用。由于p53的多功能性，在它的编码基因TP53上发现很多突变都会影响到p53的功能。在很多（75%）人的癌症中都存在p53的突变。有关p53的研究已经拓展到毒物学和治疗学领域。P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因。在短短的十多年里，人们对P53基因的认识经历了癌蛋白抗原，癌基因到抑癌基因的三个认识转变，现已认识到，引起肿瘤形成或细胞转化的P53蛋白是P53基因突变的产物，是一种肿瘤促进因子，它可以消除正常P53的功能，而野生型P53基因是一种抑癌基因，它的失活对肿瘤形成起重要作用。2p53基因的简述P53蛋白的研究与发展综述-3-2.1p53蛋白的研究历史及现状第一个10年：1979年，英国癌症研究基金会、美国普林斯顿大学的研究者LionelCrawford,，David.P.Lane等人首次追踪到了p53基因的踪迹。这些研究者或许没有料到，他们的发现开启了现代肿瘤研究与治疗的新时代。不久以后，俄罗斯科学家PeterChumakov从小鼠体内克隆到了这个基因你的完整版本。因为这一基因在细胞中翻译后产生的蛋白质(protein)的分子量为53千道尔顿，故而被命名为p53。不过，在发现伊始，p53基因并未受到重视，甚至在最初的10年中，p53一直被视为能够诱发肿瘤产生的癌基因。导致这样南辕北辙认识的症结在于科学家在研究时并未找对p53基因的正确版本。众所周知，一条基因由一系列脱氧核糖核酸按照相应的顺序彼此串联而成，如果其中的某个或某些核苷酸发生改变就意味着这条基因发生了突变，而起初研究者拿到的基因就是p53的突变版本，按照这一版本翻译成的蛋白质自然就无法行使正常p53基因的功能。P53蛋白的研究与发展综述-4-第二个10年蹉跎十年之后，美国约翰霍普金斯医学院的分子生物学家BertVogelstein最终找到了正确的p53基因，即野生型p53。不但如此，科学家的发现还为这一基因摘掉了癌基因的恶名：与此前认识恰恰相反的是，p53是一个在人体内发挥广泛作用的强有力的抑癌基因。p53蛋白实际上是一种转录因子，在细胞处于应激状态时可被诱导表达，从而促进细胞进入细胞周期的停滞阶段，继而凋亡或者衰老第三个10年自打1990?年，美国国立卫生研究院的Freuch?Anderso博士启动了全球第一个真正意义上的基因治疗临床试验以来，已有1000余例基因治疗临床试验获批上马，其中大约70%是针对肿瘤，而p53基因更是成为其中不可或缺的靶点。在我国，深圳赛百诺基因技术有限公司从1998?年开始进行重组腺病毒——p53?抗癌注射液的临床试验，2003年完成了全部临床试验，于2004?年1?月获得我国SFDA?批准的新药生产批文，成为世界上第一例正式上市的基因治疗产品。自从p53基因被认定为一种重要的抑癌基因以来，它一直就是焦点中的焦点。1993年，p53还被《科学》杂志评为当年的明星分子。直到如今，每隔一段时间，国际上就会召开一次以p53为主题的学术例会。有关p53的研究也逐渐从癌症领域发散开来，在其他疾病和生理过程中，也出现了p53长袖善舞的身影。这些发现使之成为分饰多角的最熟悉的陌生人。例如2007年，美国先进研究所的科学家在《自然》杂志上报告称，他们在小鼠中观察到，一种特定类型的p53突变可能与雌鼠能否怀孕有关。对此新加坡医学生物学研究所的发育生物学家Colin?Stewart不无戏谑的评论道：该研究结果味着，以p53为靶点的抗癌药物可能会有“额-4-外”的效果——“一些药物可能会通过提升p53在子宫中的作用成为有效的助孕剂，而另一些则可能通过阻碍p53发挥功能而成为避孕药。”另外据《自然·医学》杂志的报道，有研究者还发现p53在胰岛素抵抗（insulin?resistance）的生理调控过程中发挥了重要作用第四个10年我们正处于p53第四个10年的发展阶段，我们现在的主要目标是基于p53蛋白开发抗癌药物。P53蛋白的研究与发展综述-5-2.2p53基因及其表达产物2.2.1p53基因人类P53基因定位于17P13.1,约20Kb长，都由11个外显子和10个内含子组成，第1个外显子不编码，外显子2、4、5、7、8、分别编码5个进化上高度保守的结构域，P53基因5个高度保守区即第13～19、117～142、171～192、236～258、270～286编码区。P53基因的转录由P1、P2二个启动子控制.P1启动子位于第一外显子上游100～250bp，P2位于第一内含子内在启动子中包含1个NF1蛋白结合位点和一个转录因子AP1相关蛋白的结合位点，对正常P53基因的转录，不仅需要二个启动子的平衡作用，而且P53基因内含子也起.作用。P53基因位于人类17号染色体含11个外显子，其转录翻译编码的野生型P53蛋白由393个氨基酸残基组成，包含多个功能域。P53基因还有：序列特异的DNA结合结构域，位于氨基酸100-300位间；核定位信号NLS位于氨基酸残基316-325；四聚体寡聚化结构域，定位于氨基酸残基334-356；C-末端非专一DNA调节结构域，同时在碰到DNA损伤时，P53可能补充其它蛋白质到损伤部位，提供DNA损伤信号。2.2.1p53基因的失活引起肿瘤形成的p53蛋白是基因突变后产生的，影响了正常p53基因的抑癌作用，p53蛋白构像发生改变主要是由于p53基因的突变。野生型P53以四聚体形式与特异位点结合，反式激活下游生长抑制基因的表达，是否具有这种直接与DNA结合并激活临近基因转录的特点是野生型p53蛋白和其它具有“致癌”作用的突变型蛋白之间的差别。一系列的方式能使P53失活，在一些肿瘤中，单一或两个P53位点的丧失降低四聚体浓度，无义突变造成P53翻译中断，C端酸性结构域的丢失影响四聚体形成;最常见的是错义突变，野生型与突变体形成更稳定的四聚体，丧失正常功能。2.2.2P53蛋白的作用机制P53蛋白N一端为酸性区1～80位氨基酸残基，C-端为碱性区319～393位氨基酸残基，图1：P53蛋白结构图1p53蛋白空间结构P53蛋白的研究与发展综述-6-正常的P53蛋白在细胞中易水解，半衰期为20分钟，突变性P53蛋白半衰期为1.4～7小时不等，P53蛋白N端有一个与转录因子相似的酸性结构域，与GAL4的DNA结合区重组时，融合蛋白能激活GAL4操纵子转录，激活功能定位在P53第20～40位密码子，P53细胞定位及反式激活功能提示，P53蛋白可能直接或通过与其他蛋白作用参与转录控制.P53基因是一种转录因子，他会根据细胞的状态，从而做出不同的反应，如图2所示：当细胞受到轻度生理应激反应刺激时，会通过p53蛋白下游靶基因发挥调控作用如：维持代谢稳定状态，抗氧化作用，DNA修复，细胞代谢生长抑制等方式来修复细胞，当受到重度应激反应如原癌基因被激活，p53蛋白则会启动细胞凋亡程序，使得细胞程序性死亡。要研究某个蛋白的生化活性有一种最为常用的方法，那就是寻找能够与该蛋白发生相互作用的其它蛋白。这个方法在p53蛋白的研究当中被应用得最为广泛，也找到了非常多的能够与p53蛋白发生相互作用的其它蛋白。迄今为止，在众多p53蛋白的“伴侣”蛋白中最为著名，也最为重要的蛋白就是在1992年发现的MDM2蛋白。研究发现，MDM2蛋白能够与p53蛋白紧密结合，并抑制其生物学活性。从那以后，MDM2蛋白（人体的MDM2蛋白也被称为HDM2蛋白）就被认为可能是最重要的p53蛋白调控因子，并且是最有效的p53蛋白的“把关人”。MDM2蛋白可以通过多种方式抑制p53蛋白的作用。比如，它可以与p53蛋白的反式激活结构域相结合并抑制其活性。另外，MDM2蛋白还能起到E3泛素连接酶的作用，特异性地催化p53蛋白经泛素化途径降解。图2：p53蛋白的抑癌机制P53蛋白的研究与发展综述-7-后来的研究又发现MDM2基因居然是受p53蛋白调控的靶基因。p53蛋白和MDM2蛋白之间形成了一个负反馈环路。p53蛋白诱导MDM2蛋白表达，然后MDM2蛋白促进p53蛋白降解，从而限制胞内p53蛋白活性。经过多年的深入研究，我们了解到在非应激细胞中，p53蛋白的活性一直维持在一个较低的基础水平。这主要得益于p53–MDM2负反馈环路的作用。不过，在细胞受到各种应激信号的刺激时，p53蛋白就会迅速被激活。最早发现p53蛋白的这种可诱导特性的是WarrenMaltzman，他发现细胞经紫外线照射后，胞内p53蛋白的含量会升高。随后，MichaelKastan得到的实验结果也进一步证实了Warren的结论。在这些实验数据的支持下，p53蛋白当之无愧地被誉为“细胞基因组的卫兵”。后来的研究也进一步证实了这个观点。p53蛋白具有的这种能够被应激信号所激活的开关是p53蛋白发挥各种抑癌作用的关键（图3）。MDM2蛋白就是控制这个开关的主要调控因子，MDM2蛋白能够保证p53蛋白不会被错误激活。当细胞面临各种致瘤刺激信号时，MDM2蛋白的含量就会减少，抑制作用就会被取消，p53蛋白就会被活化（图3）。ChuckSherr等人的研究结果就支持了上述观点。他们发现ARF这种抑癌因子主要就是通过与MDM2蛋白相结合，从而“解放”p53蛋白，使p53蛋白发挥抑癌作用。3重组p533.1主要药物及类似药物（上市药物和在研药物）重组人p53腺病毒(rAd-p53)是一种广谱抗癌制品。自1995年在美国批准进入临床试验，图3：p53-MDM2环路P53蛋白的研究与发展综述-8-目前已有51项各种临床试验方案在世界各国实施，涉及到多种类型的肿瘤治疗。所有临床试验用rAd-p53制品均来源于美国和中国的三家公司即Introgen、Schering-Plough（先灵葆雅）和深圳市赛百诺基因技术有限公司（SiBiono），这也是目前世界上具有重组腺病毒制品规模化生产能力的三大产业化基地。针对P53的基因治疗，已有了数种上市药物及多种处于临床研究的药物，这里着重介绍两种上市的药物:今又生和Advexin。3.1.1今又生重组人p53腺病毒注射液（今又生），由