PCR-DGGE技术在土壤微生物多样性研究中的应用

PCR-DGGE技术在土壤微生物多样性研究中的应用1研究背景土壤是微生物生命活动的重要场所，作为土壤的重要组成部分，微生物对土壤肥力的形成与植物营养的转化起着积极的作用。土壤中微生物种类、数量的变化及分布，既反应了土壤各因素对微生物种类及分布的影响和作用，也反应了微生物对土壤肥力、物质循环及能量转化的影响和作用，直接影响着土壤的肥力状况，揭示了土壤发育现状及趋势。土壤微生物多样性是生物多样性研究的一个重要领域，研究土壤里的微生物群落结构演替规律、微生物种群动态变化对于丰富现有微生物菌种资源，保持地球微生物物种的多样性及土壤的可持续利用都具有重要意义，是当今国内外关注和研究的热点问题之一。定量和定性的描述土壤微生物多样性是微生物生态学的难题之一。长期以来，囿于研究方法的限制，人们多采用常规的分离纯化培养技术来研究土壤里复杂的微生物多样性，但是这些方法都存在着诸多不可避免的缺陷性，只能够培养出自然界里0．1％～10％的微生物，因此有关土壤微生物的多样性研究进展不大。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，DNA指纹图谱技术被不断应用于土壤微生物多样性的检测，使得人们从基因遗传水平上去更深入、更广泛地认识土壤中微生物的多样性成为可能。变性梯度凝胶电泳技术(denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE)是由Fischer和lerman于1979年最先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术。1993年MuZyer等首次将DGGE技术应用于微生物生态学研究，证实了这种技术在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性。由于DGGE具有可靠性强、重现性高、方便快捷等优点，短短的10年内，已经成为微生物群落遗传多样性和动态分析的强有力工具，被广泛用于土壤特殊微生物生理类群，自然环境条件下土壤微生物多样性变化，污染土壤，不同种植制度下的土壤以及转基因植物、微生物介入的土壤微生物多样性等方面的研究。2材料与方法2.1材料2.1.1供试土样2.1.2培养基细菌采用牛肉膏：5g；蛋白胨10g；NaCl5g；琼脂20g；水1000ml；pH7.0-7.2；121℃灭菌30min。2.1.3主要试剂细菌DNA提取试剂：0.9%NaCl，TE缓冲液（50mMTris-HCl，20mMEDTApH8.0），STE缓冲液（5MNaCl10ml，1MTris-HCl5ml，0.5MEDTA1ml，dH2O484ml），10%SDS，溶菌酶溶液（溶菌酶100mg，ddH2O5ml，-20℃保存），PCl溶液（苯酚：氯仿：异丙醇=25：24：1），异丙醇，76%乙醇。土壤总DNA提取液（100mmol/LTris-Hcl，100mmol/LEDTA，100mmol/L磷酸钠，1.5mol/L氯化钠，1%CTAB，pH8.0）扩增试剂及酶切试剂：BOXAIR引物和16SrDNA以及土壤细菌，真菌扩增引物由上海生工合成，mixture及MspI、HinfI、HaeⅢ、TaqI酶均购自上海生物工程有限公司。电泳缓冲液：Tris242g，0.5MEDTA100ml，蒸馏水定容到1000ml，用冰醋酸调节pH约为8.3。溴化乙锭染色剂：溴化乙锭100mg，蒸馏水100ml。2.2实验步骤2.2.1土壤总DNA的提取与纯化土壤总DNA提取方法参照Lian[92]的方法，并略加修改。将5g土壤样品与13.5mlDNA提取液混合。再在混合物中加入100μl蛋白酶K（10mg/ml）于225r/min的摇床上，控温37℃，30min后再加入1.5ml20%SDS，水浴2h，每隔15-20min轻轻上下颠倒几次，最后在3000r，4℃下离心10min，收集上清液，转移到50ml离心管中。再加入4.5ml提取液和0.5ml20%SDS于土壤沉淀中，充分混匀，65℃水浴2h，3000rpm离心10min，合并上清液。将上清液与等体积氯仿异戊醇（24：1）混合离心，吸水相转移至另50ml离心管中，以0.8倍异丙醇室温沉淀1h，9000rpm离心20min，收集沉淀，用70%乙醇洗涤沉淀，干燥后，溶于400μl无菌去离子水中，再采用上海生工的UNIQ-10柱式胶回收纯化试剂盒进行纯化土壤DNA样品，所得DNA溶液用1%的琼脂糖进行检测。2.2.2PCR扩增由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。因此，采用巢式PCR进行扩增。细菌的引物见表1。表1PCR扩增各类微生物的引物序列[93-96]PCR次序引物primer序列(5'-3')Sequence(5’-3’)细菌第一轮PCRF338ACTCCTACGGGAGGCAGCAGR518ATTACCGCGGCTGCTGG第二轮PCRGC(bacterial)CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG注：F-正向引物R-反向引物2.2.3PCR-DGGE操作步骤(1)操作前准备试剂配制：50×TAE缓冲溶液；0%变性溶液；100%变性溶液；10%AmmoniumPersulfate（过硫酸铵）。DGGE仪器的安装及调试。(2)DGGE操作步骤制变性胶--灌胶--胶聚合--点样--电泳--银染--成像。(3)银染本试验采用的银染方法是在传统方法的基础上进行一定的改进而成，DGGE指纹图谱分析借助于Bio-Rad公司的凝胶成像系统进行条带判读，以QuantityOne计算迁移率、强度和面积，并计算样品间的相似指数、绘制泳道间遗传图。2.2.4DGGE优势条带及特异条带的回收将优势条带和特异性的条带割下，用无菌去离子水清洗3次，并用20μl去离子水浸泡过夜，细菌和真菌分别用第二次PCR扩增时用的引物进行PCR扩增。2.2.5目标条带的克隆将扩增后的PCR产物通过回收目的条带，进行克隆。挑克隆子送上海英骏生物技术公司测序。2.2.6目标条带测序及序列比对将所测的序列，在BLAST上去除载体序列，然后通过Blast中GenBank中核酸数据进行比对分析。3土壤微生物DGGE分析3.1土壤微生物总基因组的提取和纯化3.2土壤细菌PCR扩增采用巢式PCR对土壤细菌进行扩增。前者首先利用细菌通用引物F338/R518对接近16SrDNA的全长进行扩增，得出大约1500bp左右的惟一片段；然后以该PCR产物为模板，利用特异引物GC(bacterial)扩增了16SrDNA大约430bp的片段用于DGGE分析。3.3土壤细菌的DGGE分析将第2次PCR的扩增产物进行DGGE电泳，不同处理土壤均分离到30条以上的电泳条带，但不同处理土壤样品出现的带型有一定差别。3.3.1土壤细菌DGGE分析多样性指数的计算利用Excel软件完成，数据之间的方差分析以及细菌DGGE图谱的主成分分析利用SPSS12.0完成。DGGE指纹图谱利用Bio-Rad公司的QuantityOne○R4.1.1软件进行分析。用Shannon-Wiener指数(H)，丰富度(S)和均匀度(EH)来评价细菌的多样性。根据如下公式计算：11ln(/)ln(/)ssiiHPiPiNiNNiN其中，Pi为某一条带的强度与同泳道中所有条带总强度的比值，S为每一泳道总的条带数。土壤细菌的Shannon多样性指数(H)和丰富度(S)Sampleno.Shannon多样性指数Shannon'sdiversityindex(H)丰富度Richness(S)R13.55±0.03c38.33±1.52bNR13.60±0.02bc37.67±1.15bR23.76±0.04a45.33±0.58aNR23.60±0.05bc38.33±1.15bR33.45±0.12d34.67±1.53cNR33.75±0.06a44.33±2.31aR43.65±0.05b39.00±2.00bNR43.56±0.03cd34.67±2.08cR53.49±0.02cd33.33±0.58cNR53.42±0.02d30.6±0.58d土壤细菌16SrDNADGGE指纹图谱的聚类分析图NR5R5NR4R4NR3R3NR2R2NR1R14结论与讨论通过细菌的DGGE图谱分析，供试土样的微生物多样性较为丰富，不同土样处理之间差异明显。可以看出该方法能比较好的揭示土壤微生物多样性的情况，但通过回收DGGE中的条带，并结合克隆测序，发现所回收的序列大部分为不可培养，并不能确定其具体的分类地位。以后应结合其他分子生物学方法做进一步的研究。对多样性指数的计算结果表明，无论细菌还是真菌，Shannon多样性指数都随微生物数量与DGGE条带数量多少呈正相关关系。参考文献[1]孔令武,孙海峰.现代实用中药养殖栽培技术[M].北京:人民卫生出版社,2000:147[2]郭巧生.药用植物栽培学[M].北京:高等教育出版社,2004:209[3]吕晔,陈宝儿.丹参,太子参,半夏,玄参,麦冬的栽培技术[M].南京:江苏科学技术出版社,2001:4[4]珑岛.防治连作障碍的措施[J],日本土壤肥料学杂志,1983,(2):170-171[5]高子勤,张淑香.连作障碍与根际微生态研究Ⅲ.土壤酚酸物质及其生物学效应[J].应用生态学报,2007,(9):549—554[6]蔡燕飞,廖宗文,董春,等.番茄青枯病的土壤微生态防治研究[J].农业环境保护,2002,(4),201-209[7]童有为，陈淡飞.温室土壤次生盐渍化的形成和治理途径的研究[J],园艺学报,2007,18(2),159-162[8]刘德，吴凤芝.哈尔滨市郊蔬菜大棚土壤盐分状况及其影响[J],北方园艺,1998,(6):1-3[9]张连学,朱桂香，王铁生.人参栽培技术及其应用基础的研究吉林[M].吉林农业大学学报,天津科学技术出版社,1991:255-260[10]大棚蔬菜连作障碍分析及合理施肥技术.浙江农业信息网,2004:09-16[11]唐咏,梁成华,刘志桓.日光温室蔬菜栽培对土壤微生物和酶活性的影响[J].沈阳农业大学学报(自然科学版),1999,30(1):16-19[12]吴风芝,赵风艳.根系分泌物与连作障碍[J].东北农业大学学报,2003,34(1):114-118[13]沈建波,张福锁.根分泌物的生态效应[J],中国农业科技导报,1999,1(4):21-27[14]张福锁.环境胁迫与植物营养[M].北京:北京农业大学出版社,1993,336-347.[15]YuJQ,MatusuiY.Phytotoxicsubstancesinrootexudatesofcucumber(Cucumissativus)[J].JounralofChemicalEcology,1994,20(1):21-31