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第五节PCR技术的扩展和应用多重PCR(MultiplexPCR)InversePCRNestedPCRAnchoredPCR不对称PCR技术Tail-PCR多重PCR(multiplexPCR)1.原理在一个PCR反应体系中加入多对特异性引物,针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。这一概念由Chamberian等于1988年提出。优点：多重PCR同时扩增多个目的基因,可节省时间、降低成本、提高效率,特别是节省珍贵的实验样品。2.应用2.1医学研究与应用如病原微生物的检测与鉴别，可同时进行多种病原微生物的鉴定。2.2植物学研究在植物分子育种、基因表达研究、种质纯度鉴定、病虫害检测等方面,多重PCR也得到重视。2.3海洋生物学研究海洋浮游生物数量庞大，种类繁多，而且幼体时期外形相似。研究发现，不同种类浮游生物细胞色素氧化酶I的DNA差异明显，据此，研究者可通过设计特异性引物，采用多重PCR方法进行分类鉴定。3.多重PCR的技术要素一个理想的多重PCR反应体系，并非单一PCR的简单混合，需要针对目标产物，进行全面分析、反复试验，建立适宜的反应体系和反应条件。多重PCR的技术要素主要包括目的片段选择、引物设计、复性温度和时间、延伸温度和时间、各反应成分的用量等。多重PCR的目标是多个目的片段的扩增，因此目的片段的选择是核心。目的片段必须具有高度特异性，各个目的片段之间需具有明显的长度差异，以利于鉴别。各个引物必须高度特异，避免非特异性扩增;不同引物对之间互补的碱基不能太多，否则引物之间相互缠绕，严重影响反应结果。复性温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有目的片段的长度。多重PCR反应中，在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度以确保PCR反应的特异性。复性时间略微延长，以使引物与模板之间完全结合。延伸反应的时间不宜过长，否则会导致非特异性扩增带的出现。反应体系中适当增大模板DNA、引物、聚合酶、dNTP的用量，调整缓冲液组分，以获得最佳扩增效果。反向PCR（InversePCR,IPCR）扩增位于靶DNA区段之外的两侧未知的DNA序列此方法在分子生物学研究中应用广泛，可以用于检测病毒、转座子等在基因组中的整合位点，克隆基因的邻接序列以及建立基因组步移文库等。IPCR技术一般只能获得2.0kb以内的片段。DNA的酶解程度、自连接效率以及引物在基因组中的相对专一性是IPCR成功的关键:(1)如果DNA酶切不完全，可能因片段过长而导致无法扩增或扩增得到多个产物带。实验中使用过量限制性内切酶、大酶切体积和长时间处理非常必要。(2)在酶解片段的自连接反应中，如果DNA浓度过高或反应体积过小，则可能导致生成串联多聚体。(3)普通IPCR反应使用的引物一般长20nt，退火温度相对较低，在以总基因组DNA的酶解自连物为模板进行扩增时，很可能发生非特异匹配，导致非目标产物的生成。可以使用较长的两个特异引物(25nt～30nt)，退火温度高，可最大程度地减少由引物非特异匹配引起的假阳性片段扩增。巢式PCR（NestedPCR）利用两对以上的引物扩增出不同长度片断的技术。第一对引物：外部长片断扩增引物；第二对引物：内部短片断扩增引物。巢式PCR是为了从一个DNA模板的同一区域扩增出不同长度片断即外部长片段和内部短片段而设计的特殊方法，前者的引物称外长引物，后者的引物称内部引物，特异地称为巢式引物，由它扩增出的片段也称套组片段。两类产物（外长和套组片段）的Tm值是不同的，因此在外引物和套组引物与各自靶位点融合的温度不同。在设计引物时，必须使外引物的GC%含量高于内引物，因而在一个含有不同引物的反应管中，早期的PCR循环中，长引物在较高的温度下与模板特异结合，此时内因物是被排斥的，因此扩增产物是外长片段，在后期PCR循环时，由于融合温度改变到只适于套组引物，外引物是被排斥的，因此，此时的扩增产物是套组片段。因此，巢式PCR的关键是引物设计，可以在外引物5ˊ端增加多个GC钳子（GC-clamp）达到扩增片断的目的。第一次循环时，外引物的融合温度只能比没有GC-clamp的引物稍高一点，在起始循环后，由于GC-clamp已导入初级产物，因此以后的融合温度可以提高。由于采用了两种不同退火温度的引物，所以巢式PCR的程序与普通PCR不同，整个程序中某个阶段一些引物工作，另一些引物“休闲”，在另一阶段，“休闲”的引物开始工作。巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR的特异性。另外，如果大片断扩增错误，则小片断错误扩增的概率很大。锚定PCR（AnchoredPCR）以基因组总DNA为起始材料,用于克隆某一已知片段的侧翼序列,如分离某一基因的调控序列,分析T-DNA或转座子插入突变体等。锚定PCR方法主要由以下3个步骤组成:(ⅰ)以基因组总DNA为模板,用一条基因特异性引物(GSP1)进行线性PCR扩增,产生单链扩增产物;(ⅱ)在末端转移酶的作用下,在单链DNA分子的3′末端加上多聚胞嘧啶;(ⅲ)用巢式基因特异性引物(GSP2)和与多聚胞嘧啶配对的锚定引物(AAP)对加尾的产物进行PCR扩增,PCR产物连入载体后进行测序鉴定。DNA末端核酸转移酶3′CC…CC5′CC…CC锚定引物3′CC…CC5’GG…GG首先合成第一链DNA，然后再添加一同聚物尾（polydC)，与同聚物尾配对的3′锚定引物（带有限制性内切位点polydG)一起作PCR扩增5′不对称PCR用来序列的单链DNA热不对称交错PCR(ThermalasymmetricinterlacedPCR,简称TAIL－PCR)是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术。该技术由Liu和Whitter首先研究并报道。在分子生物学研究领域中，利用该技术分离出的DNA序列可以用于图位克隆、遗传图谱绘制的探针，也可以直接测序。TAIL－PCR技术原理：由一个特异性引物和一个简并引物组合构成的PCR反应叫做“半特异性PCR。这种反应会产生3种不同类型的产物:(1)由特异性引物和简并引物扩增出的产物;(2)由同一特异性引物扩增出的产物;(3)由同一简并引物扩增出的产物。在TAIL－PCR反应中,后两种非目标产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。TAIL-PCR技术的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物(specialprime,简称sp1，sp2，sp3，约20bp),用它们分别和1个具有低Tm值的短的(14bp)随机简并引物(Arbitrarydegenerateprime简称AD)相组合,以基因组DNA作为模板,根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环,通过分级反应来扩增特异引物TAIL－PCR一般分为3次反应，第1次PCR反应由5次高特异性反应、1次低特异性反应、10次较低特异性反应和12次热不对称的超级循环构成。通过5次高特异性的反应，使sp1与已知的序列(载体或T-DNA等)退火并延伸,提高目标序列的浓度。1次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上，10次较低特异性的反应使两种引物均能与模板退火,随后进行12次TAIL循环(即高特异性和低特异性循环交替)。经过上述反应得到了不同浓度的3种类型的产物：特异性产物(Ⅰ型)和非特异性产物(Ⅱ型和Ⅲ型)。第2次反应则将第一级反应的产物稀释一定倍数后作为模板，通过10次热不对称的超级循环，使特异性的产物被选择性地扩增，而非特异性的产物被压制到极低的含量。第3次反应又将第2次反应的产物稀释一定倍数后作为模板，一般设置为普通的PCR反应或热不对称的超级循环。通过上述3次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。反应循环数温度时间(s)温度时间(s)温度时间(s)第一轮1936095605943063607215019430*7215010943044607215012943063607215094306360721509430446072150172300第二轮109430636072150943063607215094306360721509430446072150172300*:25℃保持180s后以0.3℃/s升温至72℃反应循环数温度时间(s)温度时间(s)温度时间(s)第三轮20943063607215094306360721509430446072150172600TAIL-PCR的引物设计根据载体的已知序列设计3个与其边界距离不等的嵌套的特异性引物，特异性引物的长度约20bp，Tm一般为58～68℃。按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计一系列简并引物，简并引物相对较短，长度为14bp,Tm为30～48℃。在TAIL-PCR反应中，高特异性循环的退火温度设为65℃左右，较低特异性循环的退火温度设为44℃，低特异性循环的退火温度设为25～30℃。反应体系中，特异性引物的浓度与普通的PCR相同，简并引物的浓度要高,一般为2.5～5.0μmol/L，以满足引物的结合效率。TAIL-PCR产物分析多数情况下，第1次反应有较多的非特异性产物由sp1和AD为引物扩增出的特异性片段在第1次反应中由于量少而不一定能显现出来。当用sp2替代sp1进行第2次反应后，一些非特异性条带消失，特异性的产物被选择性地扩增而显现。欲增加产物的特异性，可以再把第3次反应设置为TAIL循环。由于特异性引物在第1次反应中一般不能扩增到可被检测的水平，因此可以省去第1次反应产物的琼脂糖凝胶电泳分析，仅仅检测第2次和第3次反应的产物来获得特异性的目标片段。取第2次反应产物和第3次反应产物成对点样。由于特异引物是嵌套的，因此特异性扩增的特点是第3次反应产物小于第2次反应产物。不同的AD引物的扩增效率不同。有效的TAIL-PCR扩增出的目标片段的大小应该在250bp～2kb。由于AD引物在特异性引物的下游有多个退火位点，同一目标序列有时会产生一个以上不同长度的特异性片段。