成人骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学特性

成人骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学特性作者：毕薇薇，郭巍，赵春明，郭立斌，李志刚，BiWW，GuoW，ZhaoCM，GuoLB，LiZG作者单位：四平市中心医院中心实验室,吉林省四平市,136000刊名：中国组织工程研究与临床康复英文刊名：JOURNALOFCLINICALREHABILITATIVETISSUEENGINEERINGRESEARCH年，卷(期)：2007，11(28)被引用次数：5次参考文献(17条)1.KatayamaR.WakitaniS.TsumakiNRepairofarticularcartilagedefectsinrabbitsusingCDMP1gene-transfectedautologousmesenchymalcellsderivedfrombonemarrow2004(08)2.VaananenHKMesenchymalstemcells2005(07)3.傅文玉.路艳蒙.朴英杰人骨髓间充质干细胞的分化与端粒酶活性[期刊论文]-第一军医大学学报2001(11)4.TropelP.NoelD.PlatetNIsolationandcharacterisationofmesenchymalstemcellsfromadultmousebonemarrow2004(02)5.BosnakovskiD.MizunoM.KimGIsolationandmultilineagedifferentiationofbovinebonemarrowmesenchymalstemcells2005(02)6.TsybAF.KonopliannikovAG.KolesnikovaAIProductionofcellculturesfrommesenchymalstemcellsofthehumanbonemarrowandtheiruseinmedicine2004(09)7.RomanovYA.DarevskayaAN.MerzlikinaNVMesenchymalstemcellsfromhumanbonemarrowandadiposetissue:isolation,characterization,anddifferentiationpotentialities2005(01)8.BosnakovskiD.MizunoM.KimGChondrogenicdifferentiationofbovinebonemarrowmesenchymalstemcellsinpelletculturalsystem2004(05)9.OguraN.KawadaM.ChangWJDifferentiationofthehumanmesenchymalstemcellsderivedfrombonemarrowandenhancementofcellattachmentbyfibronectin2004(04)10.傅文玉.路艳蒙.朴英杰人骨髓间充质干细胞的培养及多能性研究[期刊论文]-中华血液学杂志2002(04)11.林琳.蔡光先.刘柏炎细胞外基质对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响[期刊论文]-中国现代医学杂志2005(11)12.LeBlancK.PittengerMMesenchymalstemcells:progresstowardpromise2005(01)13.汪萍.呼莹.姜学英造血干细胞联合骨髓间充质干细胞移植实验效果观察[期刊论文]-郑州大学学报(医学版)2006(05)14.ZhaoRC.LiaoL.HanQMechanismsofandperspectivesonthemesenchymalstemcellinimmunotherapy2004(05)15.JiangY.JahagirdarBN.ReinhardtRLPluripotencyofmesenchymalstemcellsderivedfromadultmarrow2002(6893)16.KangTJ.YeomJE.LeeHJGrowthkineticsofhumanmesenchymalstemcellsfrombonemarrowandumbilicalcordblood2004(04)17.WagnerW.WeinF.SeckingerAComparativecharacteristicsofmesenchymalstemcellsfromhumanbonemarrow,adiposetissue,andumbilicalcordblood2005(11)相似文献(10条)1.学位论文杨金凤人骨髓间充质干细胞复合PLGA的体外灌流培养及成骨细胞分化研究2008骨组织工程为骨缺损修复提供了一种新的疗法。人骨髓间充质干细胞(hMSCs)是一种理想的骨组织工程种子细胞,被广泛用于与支架材料复合构建组织工程骨。聚乳酸-乙醇酸(PLGA)支架在软骨和骨组织工程应用中显示出较好的性能而被广泛接受。灌流式生物反应器常用于培养骨骼组织。本文目的是评价灌流培养条件下人骨髓间充质干细胞在PLGA支架中的生长增殖及分化动态。实验所用支架孔隙率为94.5％-98.0％,孔径大小为280-450pm。首先通过对三个不同接种密度(1×106,2×105,4×106个/ml)接种效率的比较,确定了较为合适的接种密度(2×106个/ml)。通过对三个不同流速(0.2,0.4,0.8ml/min)培养效果的比较,确定了较为合适的灌流流速(0.2ml/min)。通过合适的接种密度和合适的灌流流速立体培养hMSCs,研究细胞在支架中的生长动态。MTT法检测细胞活力显示,在整个灌流培养期间,细胞活力持续显著增加,表明细胞增殖旺盛。DNA定量分析表明从接种到培养第6天细胞数量显著增加,之后增殖变缓。用扫描电镜(SEM)来观察细胞在支架中的分布以及细胞外基质的分泌情况,结果显示第5天细胞已经长入支架孔内部,并见有薄层基质合成；第11天,细胞外基质已形成厚厚的一层将支架基本完全覆盖。活细胞荧光染色和苏木素-伊红(H&E)染色可见细胞在支架中均匀分布。通过成骨细胞定向诱导分化实验,检测支架中hMSCs的成骨细胞分化效率。碱性磷酸酶染色和酶活性检测结果表明,成骨诱导第7天细胞已经开始进入早期分化,诱导期间持续分化；诱导组碱性磷酸酶活性显著高于对照组(未诱导组);未诱导组也检测到微量碱性磷酸酶存在,推测是灌流培养产生的剪切力所致。以上结果表明,用该灌流生物反应器系统来进行hMSCs的三维立体扩增和分化是可行的,可以用于骨组织工程研究。2.期刊论文王挺.姚行.张铭.TingWang.XingYao.MingZhang人骨髓间充质干细胞培养方法-细胞生物学杂志2006,28(6)骨髓间充质干细胞(BMMSCs)是一种多潜能的成体干细胞,在细胞治疗和组织工程上具有广阔的应用前景.对供体年龄、分离方法、培养密度、培养基和培养基质表面性质对细胞增殖的影响进行了比较,重点阐述了用人自体血清结合多种细胞因子,替代胎牛血清培养BMMSCs的效果,转染端粒酶基因的BMMSCs的增殖能力和分化潜能,以及灌注培养反应器用于大规模培养的技术进展.3.期刊论文单建林.许建中.周强.王序全.朱灏.ShahJian-lin.XuJian-zhong.ZhouQiang.WangXu-quan.ZhuHao微载体技术与普通方法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的比较-中国临床康复2006,10(41)目的:比较微载体法与普通培养瓶法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞,建立一种大量、快速获得骨组织工程种子细胞的方法.方法:实验于2003-12/2004-10在西南医院中心实验室完成.取在西南医院检查的15名健康自愿者骨髓组织进行梯度离心,采用普通培养法培养.将普通培养瓶培养的第3代人骨髓间充质干细胞分别应用搅拌式生物反应器和微载体成骨诱导培养,分别于培养的第2,4,6,8,10,12,14天检测诱导培养细胞的碱性磷酸酶活性,观察细胞增殖情况,作出生长曲线,比较两种方法细胞增殖速度(收获细胞数除以接种细胞数,为细胞扩增倍数,以之除以培养天数为增殖速度).结果:①微载体法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的增殖动力学并与普通法的比较:培养微载体法接种24h后约87%的人骨髓间充质干细胞细胞贴附于微载体并铺展,3d后生长加速,10～11d后细胞生长达最大值,最终细胞收获密度为接种时的15～20倍,微载体法诱导培养人骨髓间充质干细胞的速度是普通培养法的3～5倍,两者差异有显著性(P＜0.01).②微载体法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性并与普通成骨诱导培养法比较:两种方法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性均在培养的第12天达最大值.微载体成骨诱导细胞的碱性磷酸酶活性与普通成骨诱导方法差异无显著性(P＞0.05).结论:应用微载体技术可以成功地进行人骨髓间充质干细胞的成骨诱导,更快地扩增,利于满足骨组织工程量和质的需要.4.学位论文姜辉人骨髓间充质干细胞体外诱导为心肌细胞的实验研究2006研究目的：1.通过对人骨髓间充质干细胞的获取、分离、培养和鉴定的方法和条件的研究，观察人骨髓间充质干细胞的形态学和掌握其生长规律，找到一种最佳的培养环境，建立一套体外分离培养人骨髓间充质干细胞的方法，为深入研究人骨髓间充质干细胞的细胞特性和在组织工程方面的应用奠定基础；2.通过不同浓度的5-氮胞苷(5-aza)诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌细胞的比较，确定一种合适的诱导浓度；通过对5-aza诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞后进行鉴定，以确定心肌样细胞的结构、形态和功能；3.通过观察内皮素-1在诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞中的作用，以确定其是否可以促进人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转化。方法和结果：本研究共分三部分第一部分：人骨髓间充质干细胞在体外分离、培养及鉴定方法：标本来源于人的骨髓。采用淋巴细胞分离液行密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，再利用贴壁筛选法纯化骨髓间充质干细胞后，进行原代和传代培养，并对其进行细胞生长和形态学的观察、表面抗原的鉴定。结果：hMSCs原代培养接种24h贴壁完成，2-3天细胞呈梭形，第9天形成多个克隆，第14-16天细胞融合成单层，梭形突起变长，排列有明显方向性，细胞排列成漩涡状。传代细胞24h内完全贴壁，伸展成梭形，开始迅速增殖，7天即铺满培养瓶底，传代细胞保持原代细胞的形态特征。随代数增加，细胞得到纯化，梭形细胞达95％以上。连续传代至P8，细胞由梭形变为平坦、宽大，分裂相减少，细胞质疏松，可见空泡。传至P10,部分细胞变成圆形，折光增强，脱壁死亡。随着传代次数的增加，克隆形成率逐渐下降，10代后无明显克隆出现。hMSCs表达CD29，CD44，但不表达CD34，CD45。第二部分5-氮胞苷诱导人骨髓间质干细胞转化为心肌样细胞方法：第二代的hMSCs中分别加入浓度为2.5、5、10、20、40、80μmol/L的5-aza，作用24h后除去，继续培养4周，观察细胞的生长和形态学的变化，于诱导后第二周进行免疫组化染色检测cTnI，并计算阳性细胞转化率。利用RT-PCR技术，于诱导后1、2、3、4w，对hMSCs的ANP、BNP、α-skeletalactin、MLC-2v、GATA-4、Nkx2.5的基因表达进行检测。应用膜片钳技术对诱导后2w的hMSCs进行动作电位检测。结果：5-氮胞苷处理24h后，各组均有部分细胞发生死亡，2.5、5和10μmol/L组仅有少量细胞死亡，而20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L组约30％细胞死亡。诱导后7d，细胞形态出现变化。细胞多紧密平行排列生长，细胞体积变大，梭形细胞比例下降，多数细胞呈杆状，少部分细胞呈不规则外形、长梭形或椭圆形。40μmol/L、80μmol/L组细胞形态变化明显。2-3w，细胞增殖减慢，部分细胞脱壁死亡，细胞数量较同期未经诱导组明显减少，其中40、80μmol/L5