MDCK细胞及其微载体培养技术研究进展

MDCK细胞及其微载体培养技术研究进展摘要：疫苗是预防和控制禽流感的重要手段。传统禽流感疫苗采用鸡胚制备，此方法受很多因素的限制。传代细胞系如MDCK细胞、Vero细胞、RER.C6细胞等也被用作制备流感疫苗。MDCK细胞以其优越的性能成为流感疫苗生产的理想细胞系。本文将就MDCK细胞培养及其微载体培养技术研究进展进行了概述。关键字：MDCK细胞；微载体培养禽流感是人类至今不能有效控制的传染病之一，一直是威胁禽类安全的首要疾病。目前最主要也是最有效的控制方法就是疫苗接种。禽流感疫苗传统生产使用鸡胚，而且是疫苗生产中的一种主要方法，但此种方法在疫病大规模爆发的情况下，很容易受限于可靠的鸡胚的来源、较长的培养周期、繁琐的操作步骤以及很容易受污染等因素。除了传统的鸡胚制备流感疫苗，细胞培养流感病毒的技术相对鸡胚培养流感病毒来进行疫苗生产有明显优势，如生产周期较短，封闭的生物反应器更利于生产控制，更容易扩大生产规模，无过敏源和不存在鸡胚内源性病毒污染等。传代细胞系如MDCK细胞、Vero细胞、RER.C6细胞等也被用作制备流感疫苗。MDCK细胞具有易培养、对多种不同亚型的流感病毒株敏感、病毒用MDCK细胞培养的产量高等特点，是作为流感疫苗生产的理想细胞系。为了适应扩大化的工业生产的需要，细胞微载体培养技术已经在工业生产上日益成熟，本文就此项技术进行了概述，并对此技术在疫苗生产中的应用作了展望。一、MDCK细胞1958年，Madin和Darby在健康的雄性可卡猎犬的肾脏中分离了上皮样细胞并建立了Madin-Darbycaninekidney（MDCK）细胞系[41]。通常是以贴壁方式生长的上皮样细胞。目前，MDCK细胞系广泛用于多种病毒的扩增和纯化，如：呼肠孤病毒(Reovius)、腺病毒(Adenovirus)、犬细小病毒(Canineparvovirus，CPV)、猫粒细胞缺乏症病毒(Felinepanleukopeniavirus，FPLV)及禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)等[2-5]。数十年来，因为MDCK细胞对多种不同流感病毒株都易感，而且流感病毒在MDCK细胞中可以产生较高病毒滴度，全球研究机构都使用MDCK细胞分离和复制流感病毒，该细胞系被广泛运用于流感监测和确诊[42-43]。MDCK细胞是文献中提到的适于生产甲型流感病毒和乙型流感病毒的三种细胞之一。从MDCK细胞用于生产兽用疫苗的历史来看，它可以用来生产安全有效的兽用疫苗，且具有很高的产毒能力[47]，所以开展MDCK细胞大规模生产和制备病毒疫苗的研究具有重要意义。传统的MDCK细胞培养大多采用有血清贴壁培养方式[7]。血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种复杂混合物，其含有细胞生长所需的生长因子、激素、载体蛋白、贴壁因子、微量元素以及其他营养物质，可以有效地促进细胞生长和产物表达。然而，血清的应用也存在许多问题：易受病毒、支原体或其他病原体的污染；批间差异造成产品批次间的质量难以严格控制；大量血清蛋白的存在增加了下游分离纯化的难度，部分蛋白难以通过分离纯化手段彻底去除，影响了产品的最终质量；此外，血清来源困难、价格昂贵，大规模动物细胞培养过程中使用血清将会大大增加生产成本。以上这些问题都严重限制了MDCK细胞大规模培养。二、微载体荷兰学者vanWezel于1967年首先创立了微载体培养动物细胞技术。在微球表面培养细胞可以在较短时间内得到大量的细胞，且细胞传代只需要添加新的微载体，基本上可避免细胞在胰酶消化过程中受到的损伤，因此微载体培养细胞技术是非常方便和有意义的。早期微载体多采用合成聚合物，如PHEMA、葡聚糖等。合成聚合物制备的微载体重复性和力学性能可以达到较高水平，但缺乏细胞识别位点，影响细胞在其表面黏附、生长。天然聚合物及其衍生物因其取材方便、生物相容性好且价格低廉日渐成为微载体制备材料的首选。常用的有明胶、胶原、纤维素、甲壳质及其衍生物以及海藻酸盐等。种子细胞主要为贴壁依赖性细胞，其只有黏附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。影响细胞贴附和铺展的主要因素是二价阳离子和吸附糖蛋白。除上述两因素外，对粒径、表面光滑程度、与细胞分离难易、重复使用性等方面均有要求。微载体根据物理学特性主要分为固体微载体和液体微载体两类，以前者为常见，又分为实心微载体和大孔/多孔微载体。目前MDCK细胞培养基本选用实心微载体。实心微载体以其易于细胞在微球表面贴壁、铺展和病毒生产时的细胞感染特点而得到广泛应用，其中Cytodex系列是当前应用较为广泛的一种。实心微载体比表面积和可获得的细胞浓度均较小，细胞易受搅拌、球间碰撞、流动剪切力等动力学因素破坏。三、MDCK细胞在微载体上的培养MDCK细胞是贴壁生长的细胞，也就是需要粘附表面生长，这种生长方式不利于细胞的大规模培养。直到发现细胞可以粘附于微载体上在生物反应器中大规模培养，才逐步解决了这个问题。MDCK贴壁细胞粘附生长有一个明显的优势就是其适应性，细胞可以很容易地适应不同培养基，能在很宽泛的pH范围内生长，并且对于剪切力或者通气方式都不敏感。微载体灌流等培养方式有利于细胞的高密度培养,但用于疫苗生产，应采用流加式培养，这样可以充分提高疫苗生产滴度。目前，MDCK细胞大规模培养可以有不同的策略，通过微载体的贴壁培养或者悬浮培养。MDCK细胞贴壁培养具有许多优点，如较强的应性，剪切力不敏感等，易于大规模培养。贴壁培养的规模化培养有几种方式可以选择。一种从培养瓶扩大到细胞工厂，另一种从搅拌瓶扩大到搅拌式或波浪式反应器。迄今为止，主要的研究都聚焦于在反应器中微载体贴壁培养MDCK细胞，相关文献主要集中对于细胞生长特性比较的研究。另外，Glacken等人还研究了铵对MDCK细胞在搅拌式细胞培养瓶中生长的影响，GenzelY等人研究了微载体大规模培养系统中MDCK细胞生长和病毒复制过程的代谢规律。微载体是MDCK细胞在反应器中悬浮培养的贴壁介质。文献中，有两种微载体在MDCK细胞大规模培养中使用较多：Cytodex1和Cytodex3。两种微载体都是实心微载体。Cytodex1以交联葡聚糖基架为基础，该基架被带正电荷的N，N二乙胺基乙基基团取代。该带电基团遍布于整个微载体基架中。Cytodex3含有一层较薄的变性胶原，与交联葡聚糖基架化学偶联。Cytodex3上的变性胶原层易被胰蛋白酶和胶原酶等多种蛋白酶消化，因此，能在维持细胞最大活性、功能和完整性的同时将细胞从微载体上分离出来。不同的微载体会影响细胞的生长情况，所以，对不同微载体的选择是MDCK细胞大规模培养的首要问题。王石磊以微载体浓度、葡萄糖、氨的影响、细胞接种密度以及在生长对数期、平台期等多种因素与疫苗生产之间关系进行了实验，确定了MDCK细胞在生物反应器中的最佳培养条件，选择以微载体Cytodex1贴壁培养，培养体系为1L含10%FBS的MEM培养基，葡萄糖含量为2g/L，即11.11mmol/L，初始接种MDCK细胞数量为2×105cells/mL，微载体含量为3g/L，温度37℃，搅拌速度60rpm。通过这个条件能够得到活力最高，密度最大的MDCK细胞培养物。之后，王石磊又确定了流感病毒在以微载体为介质培养的MDCK细胞上的最优条件，胞大规模培养高效生产病毒疫苗的技术平台打下基础，掌握细胞流感疫苗生产过程中的一些关键技术。从而，缩短流感疫苗的研发和生产周期，提高我国流感疫苗的产能和品质，发展我国基于细胞制备流感疫苗的新技术。四、展望在过去的几十年里，微载体系统细胞大规模培养技术主要用于生产一些具有重要实用和商业价值的产品，如疫苗、基因工程产品等，且已积累了大量实验经验和关键实验数据。上述研究为应用微载体技术进行种子细胞大规模扩增奠定了良好基础，同时也为改善生物制品的生产工艺做出了不少贡献。理想的微载体应有利于细胞的快速附着和扩增，有利于细胞高密度生长，不干涉代谢产物的合成和分泌。展望未来，今后微载体系统大规模细胞培养技术发展的总方向是：①目前的微载体虽在某些方面进行了改善,但总体上还不能很好地同时满足操作简便、系统稳定、经济合理、生物相容性好以及对细胞的机械保护等诸多要求。应研制满足上述要求、细胞生长性能优良、吸附细胞容易并能重复使用的新型微载体；②研制规模化生物反应器和剪切力小、混合性能好的新型细胞培养系统；③在培养过程中,人们往往忽略了微载体对细胞的生物学作用。可尝试结合当今最新的纳米技术,在载体表面附着一些生物功能性分子,对培养过程进行一定的调节,同时通过不同的生物以及选择不同的加入时间,从而实现培养过程的阶段性调控。参考文献[1]韩宝三,沈柏用,张瑞,等.微载体cytodex3培养技术在大量扩增成人骨髓间充质干细胞中的应用[J].中国组织工程研究与临床康复.[2]刘成圣,孟祥红,刘晨光,等.羧甲基壳多糖微载体CX-2的生物亲和性及细胞培养研究[J].高技术通讯,2005,(10):50-56.[3]周燕,刘宝林,杨波,等.微载体培养技术的研究与进展[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(16):2945-2948.[4]过琴媛,王辉.微载体培养动物细胞技术的研究进展[J].微生物学免疫学进展,2007,35(1):73-75.[5]王常勇.采用微载体技术大规模培养组织工程种子细胞[J].生物医学工程与临床,2002,6(1):51-54.[6]张前程,张凤宝,姚康德,等.动物细胞培养生物反应器研究进展[J].化工进展,2002,(08):34-36.[7]韩德胜,李振平,李薇,等.微载体规模化培养细胞的研究[J].微生物学免疫学进展,2005,33(3):34-36.[8]刘轶,朱国强.动物细胞培养及微载体技术研究进展[J].吉林农业大学学报2007,29(2):203-206.[9]MadinSH,DarbyJrNB.Establishedkidneycelllinesofnormaladultbovineandovineorigin.ProcSocExpBiolMed,1958,98(3):574-576.[10]GenzelY,BehrendtI,KonigS,etal.MetabolismofMDCKcellsduringcellgrowthandinfluenzavirusproductioninlarge-scalemicrocarrierculture.Vaccine.2004,22:2202-2208.[11]Anonymous.Influenzavirusvaccineliveintranasal-MedImmunevaccines:CAIV-T,influenzavaccineliveintranasal.DrugsRD,2003,4(5):312–319.[12]BelsheRB,MendelmanPM.Safetyandefficacyofliveattenuated,cold-adapted，influenzavaccine-trivalent.ImmunolAllergyClinNorthAm,2003,23(4):745–767.[13]KatzJM,WebsterRG.EfficacyofinactivatedinfluenzaAvirus(H3N2)vaccinegrowninmammaliancellsorembrocatedeggs.J.Infect.Dis.160,191–198(1989).[14]KistnerO,BarrettPN,MundtW,etalDevelopmentofamammaliancell(Vero)derivedcandidateinfluenzavirusvaccine.Vaccine.1998,16(9-10):960-968.[15]vanWezelAL.Growthofcell-strainsandprimarycellsonmicro-carriersinhomogeneousculture.Natu