Leptin受体基因多态性与猪产仔数繁殖性状的相关性研究

I石河子大学动物科技学院本科毕业论文Leptin受体基因多态性与猪繁殖性状的相关性研究院（系）：动物科技学院专业：动物科学学号：2011513021姓名：赵智伟指导教师：黄涛（副教授）新疆石河子2015.6.Leptin受体基因多态性与猪产子数的相关性研究2摘要本试验采用PCR-SSCP技术对大白和长白猪leptinreceptor基因的多态性进行研究。结果表明，LEPR-EXON-4的PCR片段SSCP分析表现有多态性。随后的测序结果表明引物lepr-4在猪种出现2种基因型，大多表现AA基因型和以A等位基因为主，其次是AB基因型。基因型频率分别为0.94和0.06.。关键词：leptin受体基因;猪;生产性状AbstractThistestusesPCRandSSCPtechniquetostudyYorkshireandLandraceleptinreceptorpolymorphismgenotypes.TheresultsshowedthereweretwoallelesandtwogenotypesinPCRproductsofleptinreceptorgene.Subsequentsequencingresultsshowedthattheywerealltherewasvariationinthecorrespondingarea.Theresultofpopulationgeneticsanalysis,showedthatinthemutationoflepr-4,thefrequencyofABgenotypeweresignificantlyhigherthanABgenotype，itis0.94and0.06.Keywords：leptinreceptorgene;sow;calvingtraits3目录1引言.............................................................................................................................42材料与方法................................................................................................................42.1材料.........................................................................................................................42.1.1试验样品...........................................................................................................42.1.2药品和试剂......................................................................................................42.1.3仪器和设备.......................................................................................................42.2方法..........................................................................................................................42.2.1引物设计...........................................................................................................42.2.2DNA提取.........................................................................................................42.2.3PCR扩增...........................................................................................................52.2.4多态性检测.......................................................................................................52.2.5数据处理..............................................................................................53结果与分析.............................................................................................................53.1PCR扩增................................................................................................................53.2SSCP分型................................................................................................................53.3基因型频率与基因频率.......................................................错误!未定义书签。3.4leptinreceptor基因与产仔数的关系............................................................74结论与讨论..............................................................................................................7参考文献........................................................................................................................8Leptin受体基因多态性与猪产子数的相关性研究4Leptin受体基因多态性与猪产仔数的相关性研究1引言产仔数是猪最为重要的经济性状之一,但由于其遗传力很低，常规选育进展缓慢。分子标记技术为加快繁殖性状的选育提供了新的途径。本研究组在前期研究中发现，Leptinreceptor(LEPR)受体基因在卵泡期第4天梅山与杜洛克猪中等卵泡之间存在表达差异[文献]，该基因可能对猪排卵数和繁殖力有重要影响，其多态性与猪的产仔数可能有关联。Leptin受体是Leptin作用于下丘脑的一座桥梁,Leptin通过下丘脑的特定受体抑制摄食、增加能量消耗,在脂肪蓄积、体重调节中起着重要作用[文献]，已受到广泛的重视。大量研究已证明,leptin与leptin受体基因在调节动物脂肪沉积方面有着重要的作用,血清leptin水平能反映机体能量代谢和脂肪沉积状况[文献]。同时,leptin和动物体内多种激素存在相互作用,其对动物机体的调节机理非常复杂。日本论文的情况呢？本研究以大白和长白猪为材料，应用SSCP技术对基因进行突变分析，旨在推断DNA片段中的碱基突变位点，并分析其多态性对猪繁殖性能的影响。2材料与方法2.1材料2.1.1试验样品产仔2胎以上且产仔繁殖记录完整的大白和长白纯种母猪300头,来源于新疆石河子市某种猪场。采取试验猪的耳组织，用酒精冲洗干净后放入EP管中，保存于-20℃的条件下,记录母猪的窝产仔数和窝产活仔数。2.1.2药品和试剂DNA提取试剂盒购自于天根生物科技有限公司，2×EsTaqMasterMix购买于北京康为世纪生物科技有限公司。2.1.3仪器和设备PCR仪和凝胶成像系统,分别产自BIO-RAD公司和GelDocTMEQ凝胶成像分析系统公司；离心机产自Eppendorf公司，以及国产电泳仪，水浴锅等。2.2方法2.2.1引物设计根据中的猪LEPR基因序列设计引物,由华大基因公司合成。引物序列为LEPR-exon4-F：5´-TCTATGTGTCTTTTAAATGTCCTAACA-3´，LEPR-exon4-R:5´-CAGTTAAGTAACAGCTAATGCTTGG-3´2.2.2DNA提取5采用组织基因组DNA提取试剂盒提取DNA，TIANampGenomicDNAKit购自于TINAGENBIOTECH公司。先将猪耳组织打碎处理为细胞悬液，离心弃上清，加200L缓冲液GA震荡至悬浮，加入20LProteinaseK混匀，56℃水浴振荡2h，离心去除管内壁水珠，加入200L缓冲液GB混匀，70℃放置10min，离心，加入200L无水乙醇，充分震荡混匀15s，出现絮状沉淀，简短离心，用500L缓冲液GD抽提1次，700L漂洗液PW抽提2次，将沉淀的DNA溶于TE中，-20℃保存，备用。2.2.3PCR扩增LEPR基因扩增的反应体系15ul:康为世纪Mix6.5ul,上、下游引物各0.4ul,DNA模板0.5ul,灭菌去离子水7.2ul。基因扩增程序为:94℃预变性2min；98℃变性10s；55℃退火30s；68℃延伸40s,30个循环；72℃延伸5min；4℃60min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。2.2.4多态性检测可以具体一点PCR产物3ul,10×Buffer9ul;98℃变性10min,然后冰浴至上样，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。上样前电泳仪先230V电压预电泳，上样完毕后220V电压分层，然后130V电压电泳13个小时，电泳后，银染显色，在凝胶成像系统上照相并记录结果。2.2.5数据处理整理基因型数据,计算所测猪群体中LEPR基因的基因型频率、基因频率,用SPSS13.0分析产仔数在各基因型母猪间的差异显著性,数据用平均数±标准差表示。3结果与分析3.1PCR扩增LEPR基因扩增通过PCR扩增后，用1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳得到一条长度在100-250bp之间的片段，扩增片段与目的片段大小一致，如图1。图13.2sscp分型Leptin受体基因多态性与猪产子数的相关性研究6LEPR基因PCR扩增产物凝胶电泳后检测出AA、AB2种基因型,没有检测到BB基因型（见图2）。图2图2leptinreceptor基因leptinreceptorsscp检测结果注:泳道1、2、3、7、9、11、12为AA基因型；泳道5、6为AB基因型；M为DNAMarkerI。3.3测序验证对不同基因型个体进行测序,可知在所扩增序列160位上为C突变,在171位上为T突变，在172位上为C突变，如图3。两种基因型的图都要有3.4基因型频率与基因频率根据基因型检出个数,计算基因型频率和基因频率。结果显示,AA型频率最大,为0.94;AB型频率,为0.06,7表1：种猪氟烷基因多态性分布3.4leptinreceptor基因对繁殖性状的影响根据试验猪群中leptinreceptor基因各基因型检出个数和对应