扬州大学《现代分子生物学》 5-分子生物学研究方法

第五章分子生物学研究方法5.1重组DNA技术发展史5.2DNA操作技术5.3基因克隆技术5.4基因表达研究技术5.5蛋白质组学及研究技术5.1重组DNA技术发展史40年代明确了遗传的物质基础是DNA50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制，解决了基因的自我复制和遗传信息传递问题。50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。5.1.1重组DNA技术诞生的理论基础5.1.2关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基1、DNA分子的切割与连接技术限制性核酸内切酶和连接酶的陆续发现，才使分子生物学家有了进行DNA操作的基本工具。2、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立1970年M.Mandel和A.Hige发现，大肠杆菌的细胞经过氯化钙适当处理之后，便能吸收λ噬菌体的DNA。1972年美国斯坦福大学S.Cohen报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立，对重组DNA技术的创立具有特别重要的意义。3、Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链反应5.1重组DNA技术发展史重组DNA技术(recombinantDNAtechnique):是按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组,再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA的大量拷贝。基因克隆(genecloning)分子克隆(molecularcloning)5.1.3重组DNA技术的概念5.1重组DNA技术发展史5.1.4重组DNA技术的基本步骤1、四大要素①外源基因②载体③工具酶④受体细胞5.1重组DNA技术发展史2、重组DNA技术的基本步骤①目的基因的获得与载体的制备②目的基因与载体DNA的连接③重组DNA分子导入受体细胞④重组体的筛选与重组DNA的鉴定⑤克隆基因的表达及表达产物的检测与分离纯化5.1重组DNA技术发展史重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交5.1重组DNA技术发展史5.1.5重组DNA技术的意义重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟重组DNA技术缩短了进化时间重组DNA技术使人能对生物进行定向改造体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物学的研究领域，这对医学上各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意义。5.1重组DNA技术发展史酶类功能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶Ⅰ按5‘到3’方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5’-OH末端末端转移酶在双链核酸的3‘末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶Ⅲ从DNA链的3’末端逐个切除单核苷酸λ噬菌体DNA外切酶从DNA链的5’末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5’或3’末端的磷酸基团5.1.6重组DNA实验中常见的主要工具酶5.1重组DNA技术发展史限制性核酸内切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶分类:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）5.1、重组DNA技术发展史第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶5.1重组DNA技术发展史Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)即反相重复结构，是DNA分子中以某一处为轴，其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG5.1重组DNA技术发展史BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口5.1重组DNA技术发展史DNA连接酶:通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片断连接成一个整体DNA分子。T4¯DNA连接酶EcoRI连接酶T7¯DNA连接酶5.1重组DNA技术发展史目的基因的来源原核细胞真核细胞：cDNA或gDNA文库人工合成及PCR扩增目的基因天然DNA（染色体DNA、病毒DNA(噬菌体DNA)、质粒DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA）5.1重组DNA技术发展史（八）重组实验中的主要载体定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。5.1重组DNA技术发展史克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。5.1重组DNA技术发展史载体的选择标准能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。5.1重组DNA技术发展史噬菌体载体：双链DNA病毒，约50kb,两端有一个12个核苷酸5′端突出粘性末端λ噬菌体黏粒、YAC、BAC：高容量载体5.1重组DNA技术发展史个克隆载体所容纳的外原DNA片段的大小质粒：10kbλ噬菌体：23kb黏粒：45kbBAC：350kbYAC：1000kb5.1重组DNA技术发展史以质粒为载体的DNA克隆过程5.1重组DNA技术发展史5.2.1细菌转化5.2常见的DNA操作技术转化（transformation）：P151感受态细胞（Competentcells）：受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许有外源DNA的载体分子通过，处于这种状态下的细胞称~将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状转导？转染？常用的转化方法：化学转化（CaCl2）法电击法5.2常见的DNA操作技术化学转化原理：在0℃冷冻处理时，处于CaCl2低渗溶液中的大肠杆菌细胞膨胀成球形。DNA可吸附于其表面。在短暂的热冲击下，细胞吸收外源DNA，然后在丰富培养基内复原并增殖，表达外源基因。5.2常见的DNA操作技术5.2常见的DNA操作技术P1535.2常见的DNA操作技术电击转化：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。菌液：生长对数期场强(最大转化效率)：12.5-15kV/cm温度：0-4℃5.2常见的DNA操作技术克隆的筛选：抗生素基因。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等-互补蓝白斑筛选营养条件（自养、异养）5.2常见的DNA操作技术-互补筛选5.2常见的DNA操作技术β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列的质粒编码β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主细胞IPTG/X-gal的培养基上筛选蓝白斑蓝白斑筛选LacZ,IPTGX-galX+gal（白色）（蓝色）LacZ（失活）,IPTGX-galX-gal（白色）（白色）5.2常见的DNA操作技术蓝白斑5.2常见的DNA操作技术转化率的计算：转化体总数＝菌落数×（转化反应原液总体积/涂板菌液体积）插入频率＝白色菌落数/蓝色菌落数+白色菌落数转化频率＝转化体总数/加入质粒DNA的量（计算出每微克的转化菌落数）5.2常见的DNA操作技术5.2.2聚合酶链式反应（PCR）技术1985年，K.Mullis等研究成功的一种在体外快速扩增特定基因DNA序列的方法原理：类似于天然的DNA复制过程。将待扩增的DNA片段和两侧互补的两段寡核苷酸引物，经过变性，退火和延伸若干个循环后，DNA扩增倍数可达2n倍5.2常见的DNA操作技术反应体系模板DNA：待扩增的目的片段特异性引物：人工合成的与待扩增的靶DNA两端序列互补的寡核苷酸片段，15-30bpDNA聚合酶dNTP含有Mg2+的缓冲液5.2常见的DNA操作技术PCR的基本反应步骤：1.变性：95℃，模板DNA变性为单链；2.退火：50℃左右，使引物与模板DNA退火结合；3.延伸：72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。上述三个步骤为一个循环，经25-30次循环后，可将模板DNA扩增达百万倍。5.2常见的DNA操作技术PCR技术在基因克隆方面的应用（1）目的基因的直接克隆，（2）通过RT-PCR进行cDNA的克隆；（3）制备DNA探针，进行分子检测等。5.2常见的DNA操作技术5.2.3cDNA文库cDNA文库(complementaryDNAlibrary)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。5.2常见的DNA操作技术构建步骤：1、高质量mRNA制备：纯化试剂盒，生物素P1562、反转录生成cDNA:反转录酶，olig(dt),R63、与噬菌体载体分子连接4、噬菌体的包装5.2常见的DNA操作技术5.2常见的DNA操作技术mRNA逆转录酶cDNA复制双链cDNA载体重组DNA分子受体菌含重组分子的转化菌5.2常见的DNA操作技术文库中筛选目的基因DNA探针：带有特殊碱基序列的单链DNA或RNA分子,可以用放射性物质或免疫性物质标记,通过杂交,DNA探针常用于检测互补的碱基序列。5.2常见的DNA操作技术5.2.3SNP技术应用（singlenucleotidepolymorphism）单核苷酸多态性，指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，源于单个碱基的转换或颠换应用：遗传病研究、动植物遗传育种5.2常见的DNA操作技术5.2.4基因敲除技术（geneknock-out）通过一定的途径使特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用同源片段替代靶基因片段，进行精确的定位修饰和基因改造，同染色体一起稳定遗传二、常见的DNA操作技术完全基因敲除条件型基因敲除植物基因敲除株系筛选（T-DNA插入失活）5.2常见的DNA操作技术5.3基因克隆技术简介5.3.1RACE(rapidamplificationofcDNAends)一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3′或5′端之间未知序列的方法。mRNA的获取去磷酸化加寡聚接头（5′）反转录合成第一条cDNA5´RACE，扩增5未知序列3′RACE扩增3′未知序列5′已知的接头序列；基因特异反向序列3′寡聚dT下游序列；基因特异反向序列5.3基因克隆技术简介5.3.1cDNA差示分析法(cDNA-RDA法)差减杂交与RT-PCR方法相结合，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异扩增目的基因片段5.3基因克隆技术简介5.3基因克隆技术简介主要步骤是：mRNA逆转录为cDNA，用4碱基识别酶消化，与接头1连接，PCR扩增；去除接头1，扩增子接上接头2，与驱逐子杂交，PCR扩增；去除接头2，加上接头3，再与driver杂交，再扩增，筛选出目的片段、克隆、测序。5.3.3酵母双杂交体系（Yeasttow-hybridsystem）基于对真核生物调控转