MicroRNA对上皮-间质转化的影响

MicroRNA对上皮-间质转化的影响MicroRNAplaysanimportantroleinepithelial-mesenchymaltransition【摘要】上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)是指上皮细胞在一系列影响因素的作用下转化为具有间质表型的细胞。研究显示，EMT与肿瘤的侵袭和转移密切相关。MicroRNA(miRNA)是一类具有基因转录后调控作用的非编码小RNA也参与了EMT过程，本文就miRNA对EMT的影响做一综述。【关键词】上皮-间质转化，小RNA,肿瘤【引言】1.上皮间质转化的介绍现如今，绝大多数肿瘤造成的死亡并不是由于原发性肿瘤引起，而是由癌细胞的转移造成。在上皮细胞的转移研究中，上皮-间质转型（EMT）成为研究的热点。上皮—间质转型是是指细胞在受到物理、化学等因素的作用下，由有极性分布、静止的上皮细胞转化为无极性分布、运动活跃的间质样细胞的过程。这个概念最初是在1982年被提出的.Greenburg和Hay【1】发现晶状体上皮细胞可暂时失去细胞极性,在胶原凝胶中转化为间质细胞样形态,获得了移行能力,从而提出了EMT这一说法.随后的大量研究发现,EMT不仅在多细胞生物胚胎发育过程中起作用,而且在器官纤维化(如肝脏纤维化、肾脏纤维化等)以及肿瘤侵袭和转移中也起着重要作用。2002年，Theiry和Weinberg提出恶性肿瘤细胞发生转移前会发生上皮－间质转化以获得间质细胞所具有的运动和侵袭能力，从而进入血道、淋巴道进行远处转移。EMT是一个复杂的具有多种调节机制的动态过程［2］。其分子变化特征如下：上皮细胞黏附相关分子(如E－钙粘蛋白)、上调间质细胞特征相关分子(如N－钙粘蛋白)及表达各种细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)相关蛋白表达下调。引起的细胞改变包括:细胞之间黏附的丧失，细胞所附着基底膜和ECM的破坏以及细胞骨架重建导致细胞迁移力和运动能力增强。此过程受多因素调控，在诱导EMT形成的模型中，信号分子与细胞膜表面特异性受体结合，进而通过细胞内各条不同的信号传导途径活化，激活核内转录因子，从而使细胞表型发生不同程度的转化。EMT涉及的信号通路主要有［3］：转化生长因子β1(transforminggrowthfactorbeta1，TGFβ1)信号传导通路、低氧诱导因子(Hypoxicinducedfactor，HIF)信号通路、GSK－3β磷酸化信号通路、Wnt/β－catenin信号通路等。目前对EMT的研究主要涉及上述通路以及生长因子受体（hepatocytegrowthfactorreceptor，HGFR）、表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EFGR)、成纤维细胞生长因子受体(fibroblastgrowthfactorreceptor,FGFR)等多种蛋白受体，ZEB1、ZEB2、TWIST等多个转录因子。有关EMT的通路示意图如图1示。根据上图将具体的一些重要的通路和影响因子作一详细介绍。多年的研究结果提示：血清TGFβ1水平不仅与肿瘤恶性程度呈正相关，而且也是有效的EMT诱发因素。核转录因子kappaB(nuclearfactorkappaB，NF-κB)是TGF通路诱导EMT发生的重要分子，同样可以促进Snail转录因子的表达，从而下调E-黏附蛋白的表达水平。Wnt通路也是EMT中1条重要的信号通路，β-连蛋白是Wnt信号通路中的关键蛋白，其通过介导与E-黏附蛋白间的相互作用参与细胞间的黏附。β-连蛋白磷酸化破坏了E-黏附蛋白/β-连蛋白复合物的结构，导致细胞黏附力下降，使肿瘤细胞浸润、转移的能力增强。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyIinositol-3kinase，PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路中PI3K的作用是使磷脂酰肌醇发生磷酸化，产生第二信使进入细胞内进行信号转导。PI3K有2种激活方式，一种是通过Ras和p110直接结合，导致PI3K的活化；而另一种则是与具有磷酸化酪氨酸残基的生长因子受体或连接蛋白相互作用，引起构象改变而被激活。AKT是PI3K信号转导通路的下游信号，活化的AKT可通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白，进而调节细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移。Ras/MAPK通路受体酪氨酸激酶是一类具有受体酪氨酸激酶活性的膜受体，是小GTP结合蛋白超家族成员。MAPK主要参与细胞的增殖、分泌以及神经元分化等生物反应的调节。丝氨酸/苏氨酸酶Raf信号作为Ras的效应物，其削弱TGF的生长抑制和诱导凋亡作用，强化TGF的致侵袭效应，从而诱导MDCK细胞发生EMT。目前研究较多较成熟的信号通路下游有关EMT的转录因子主要是Snail、Slug、SIP1及Twist等。这类DNA结合蛋白可以通过同SIP1竞争性结合E-黏附蛋白基因启动子部位的E-box连接序列，直接下调E-黏附蛋白及上调间质来源的波形蛋白表达，从而引起EMT。Twist还能直接增强Snail的表达促使肿瘤细胞发生EMT。而miRNA与EMT关系的研究主要集中在TGF-β途径和某些因子，还有很大的空间进一步研究。2．有关microRNA的介绍［20］1993年，Lee等首先在秀丽新小杆线虫发现MicroRNA(简称miRNA)家族的第一个成员lin－4。随后，研究者陆续在多个生物物种中鉴别出上万种miRNAs。小RNA的长度约为22个核苷酸，广泛存在于真核生物中，参与调节细胞代谢、增殖、凋亡、分化和发育。miRNA的广泛存在与进化保守性也暗示着它在生命活动中必不可少的调节作用，目前已鉴定的人类miRNA约700余种，调节人体内三分之一mRNA的表达。近年的研究表明其与人类肿瘤的发生和发展关系密切［4］。在细胞核内，编码miRNA的基因在RNAⅢ内切酶的作用下合成前体miRNA，随后转运出细胞核，在细胞质内被Dicer剪切成21－25个核苷酸长度的双链RNA。双链RNA中的一条单链会与RNA诱导的沉默复合体结合，另一条链发生降解。miRNA参与基因调控的主要方式有两种:miRNA和靶mRNA完全互补时将促进其降解;miRNA和靶mRNA不完全互补时则抑制其翻译。由此可见,miRNA通过诱导靶mRNA降解或抑制靶mRNA翻译在转录后水平调控基因表达,扮演着促癌或抑癌形成的双重角色,同时也参与到疾病的进展以及肿瘤EMT过程的各个环节,显示了其作为诊断、预后标记物以及肿瘤治疗新靶向的可能性.miRNA作为一个大家族，不同的miRNA对EMT的作用并不相同，有些促进细胞内皮表型，抑止癌细胞的侵袭，有些促进细胞的间质表型，达到增强细胞转移的能力的能力，从而使转移灶形成，加重癌症。内皮表型→→→→→→EMT→→→→→→→→→→间质表型miRNA表达水平图2，概括描述miRNA对于细胞内皮表型（左）或间质表型（有）起重要作用3．对于EMT过程起促进作用的miRNA3.1起负性调节的miRNA［18］［19］miR-200［5］家族包括miR-2f10a、miR-200b、miR-2c、41及miR-429，由于其位于不同的染色体可分为两个基因簇：miR-200b、miR-200a、miR-429和miR-200c［14］、miR-141，分别定位于染色体1p36．33和12p13．31。由于miR-200b、miR-200c、miR-429具有相同的核心序列“AAUACU”，miR-200a、miR．141有共同核心序列“AACACU”，又可在功能方面分为两个子家族。预测同一家族中的成员可能具有相似的靶基因谱，并可能参与相同或相关的生理过程。目前miR-200在EMT中的作用机制研究较为清楚的，是miR-200［6］直接作用于E-cad转录抑制因子——zEBl、2及EMT激活剂转化生长因子B，进而调节EMT相关基因如E-cad、紧密连接蛋白Z03、间隙连接蛋白和斑菲素蛋白等的表达。ZEBl也可直接抑制miR-200的转录［17］，并强烈激活癌细胞上皮分化，促进EMT和肿瘤的侵袭。miR-200和ZEBl相互抑制形成一个互反馈回路.在乳腺癌中yndyak等发现，miR－200b和miR－200c可通过靶向调控E－钙粘蛋白的转录抑制因子:ZEB1、ZEB2来上调E－钙粘蛋白，阻止肿瘤进展的关键过程EMT。在具有间质表型的乳腺癌细胞MDA－MB－231和乳腺导管癌细胞BT－549中，miR－200家族介导的E－钙粘蛋白转录上调与ZEB1的转录抑制直接相关，与E－钙粘蛋白启动子中的组蛋白H3乙酰化增加间接相关。Eades等通过检测正常乳腺上皮细胞中TGF－β介导的转化模型，证明III类组蛋白脱乙酰酶沉默信息调节子1(silentinformationegulator1，SIRT1)在EMT过程中过表达，而miR－200a［7］的表观基因沉默与SIRT1的过表达相关，此外，还在乳腺癌病人样本中观察到SIRT1过表达与miR－200a下降相关，说明miR－200a以SIRT1为靶基因调节SIRT1转录进而影响EMT过程。Moes等发现，MCF7乳腺癌细胞Snai1介导的EMT过程中，miR－203和miR－200家族成员都以一种及时的相关方式被抑制，重要的是miR－203抑制内源性Snai1组成一个双阴性miR－203/Snai1反馈回路，将这个新的miR－203/Snai1回路与已知的miR200/ZEB回路集合到一起构成了EMT核心网络。在卵巢癌中，当miR-200a在CD133/1+细胞中过表达，ZEB2的mRNA和蛋白质水平都会表达下降，导致E-cadherin表达上调，从而可以抑制EMT的过程，继而抑制癌细胞的转移和扩散。通过westernblot和免疫荧光可以直接证明miR-200a作用靶点就是ZEB2。在高转移胃癌细胞系和转移组织中miR－7显著下调，功能获得和功能缺失实验以及体内转移实验都证实miR－7与胃癌的侵袭和转移有关。miR－7通过调控靶基因胰岛素样生长因子－1受体(IGF1R)，抑制Snail，增加E－钙粘蛋白表达并部分逆转EMT，从而发挥抗转移作用。转录共抑制因子羧基端绑定蛋白1(Carboxyl－terminalbindingrotein1，CtBP1)可抑制多种抑癌基因表达，Deng等发现在黑色素瘤细胞系中miR－137的表达与CtBP1水平成负相关，靶扫描推测miR－137的结合位点在CtBP1的3＇UTR，其表达增加CtBP1的下游效应器如E－钙粘蛋白和Bax，研究提示miR－137可能是通过直接靶向CtBP1来抑制EMT过程的。食管癌方面，Matsushima等证实miR－205可通过靶向ZEB2来抑制EMT，WesternBlot结果显示:敲除miR－205后，食管鳞癌细胞中ZEB2表达大幅度增高，同时伴随E－钙粘蛋白的减少。在头颈部鳞癌领域，Liu等发现miR－138通过3种不同的方式调节EMT:①直接靶向波形蛋白mRNA，在修饰水平控制该蛋白表达;②靶向ZEB2，调节E－钙粘蛋白的转录活性;③靶向表观基因调节因子EZH2(enhancerofzestehomologue2)，调整它在下游基因的沉默效应。P53/miR-34轴可以调节Snail依赖的EMT过程。在P53表达的野生型细胞中，Snail依赖的EMT在多种肿瘤细胞中表现，如结肠癌，乳腺癌，和肺癌细胞等，但是在这些细胞中miR-34表达下调。miR-34［12］直接作用在Snail高度保守的3’非编码区，从而抑制Snail的活性。miR-34还可以作用于Snail的重要调控分子，包括β-连环蛋白,LEF1,andAxin2.最终达到抑制EMT的结果。在多种癌细胞中发现miR-138下调，包括头部和颈部鳞状细胞癌，之前实验证明，miR-138下调与间充质样细胞形态和增强细胞迁移和侵袭相关。实验证实下调的miR-138的诱导变化伴随着E-cad的显着下降（E-cadherin蛋白），表