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miRNA-9通过Notch通路调控骨性关节炎软骨细胞增殖和分化的机制研究论文的创新点：骨性关节炎是骨科常见病，其发病机制仍尚不清楚。近年来，miRNA被发现能够参与细胞增殖、分化、凋亡等多种信号调控通路，以及多种生理和病理过程。但总体来讲，miRNA与骨性病变的直接相关性研究还较少。Notch通路是调节软骨细胞向成骨细胞的增殖与分化的关键通路之一。据报道，激活Notch通路可促进软骨细胞向成骨细胞的增殖与分化。目前有研究发现微小RNA（miRNA）的异常调控与骨性关节炎的发生密切相关。本研究通过构建miRNA-9的真核表达载体，探讨其在调控软骨细胞向成骨细胞的增殖与分化中的作用，并分析miRNA-9对Notch通路的调控作用。本研究中，我们将传代的关节炎软骨细胞分为两组:A组:PEFmiRNA-9和PSV2neo共转染组,B组:PEE和PSV2neo共转染组,取正常软骨细胞作为C组。A组为实验组,B,C两组为阳性对照组和阴性对照组。采用Real-timePCR检测miRNA-9在两组骨性关节炎细胞中的表达，采用流式细胞法检测过表达的miRNA-9对骨关节炎软骨细胞凋亡的影响，利用MTT法及ALP法检测观察两组细胞的增殖和分化情况，Westernblot检测两组细胞中Jagged1和Notch1蛋白的表达水平。结果显示miRNA-9在关节炎细胞中的表达较正常软骨细胞明显下调(P=0.009)；Real-timePCR显示：A组细胞后miRNA-9的表达明显上调。AnnexinV-FITC检测显示miRNA-9过表达能够显著抑制骨关节炎细胞的凋亡率。Westernblot检测显示miRNA-9过表达可以显著下调Jagged1和Notch1蛋白的表达水平。本研究结果证实，Notch信号通路在骨性关节炎软骨细胞向成骨细胞诱导分化中起积极作用。miRNA-9抑制了软骨细胞向成骨细胞的分化。这种抑制可能是通过下调Notch信号通路的配体Jagged1和受体Notch1来实现的。我们分析，miRNA-9可能通过激活cAMP/PKA、PLC/PKC等信号通路发挥作用。本研究结论为进一步了解骨性关节炎的发病机制奠定了一定的实验基础。【摘要】背景：目的：探讨miRNA-9通过Notch通路调控骨性关节炎软骨细胞增殖和分化的影响。方法：比较miRNA-9在正常和骨性关节炎软骨细胞中的表达情况，将传代的关节炎软骨细胞分为两组:A组:PEFmiRNA-9和PSV2neo共转染组,B组:PEE和PSV2neo共转染组,取正常软骨细胞作为C组。A组为实验组,B,C两组为阳性对照组和阴性对照组。采用Real-timePCR检测miRNA-9在两组骨性关节炎细胞中的表达，采用流式细胞法检测过表达的miRNA-9对骨关节炎软骨细胞凋亡的影响，利用MTT法及ALP法检测观察两组细胞的增殖和分化情况，Westernblot检测两组细胞中Jagged1和Notch1蛋白的表达水平。结果：Real-timePCR显示miRNA-9在关节炎细胞中的表达较正常软骨细胞明显下调(P=0.009)；成功构建PEF-miRNA-9真核表达载体，Real-timePCR显示：A组细胞后miRNA-9的表达明显上调(P=0.003)。AnnexinV-FITC检测显示miRNA-9过表达能够显著抑制骨关节炎细胞的凋亡率(P=0.03)。Westernblot检测显示miRNA-9过表达可以显著下调Jagged1和Notch1蛋白的表达水平。结论：miRNA-9过表达可能通过下调Notch通路的表达进而抑制骨性关节炎软骨细胞的分化。【关键词】骨性关节炎；miRNA-9；Notch通路；增殖和分化StudyonthemechanismofmiRNA-9regulatingtheproliferationanddifferentiationofchondrocytesinosteoarthritisbyNotchpathway【Abstract】背景：Objective:ToinvestigatetheeffectofmiRNA-9ontheproliferationanddifferentiationofchondrocytesinosteoarthritisbyNotchpathway.Methods:ComparedmiRNA-9innormalandosteoarthriticcartilagecellsexpression.Thechondrocytesweredividedintotwogroups:groupA:PEFmiRNA-9andPSV2neocotransfectiongroup,Bgroup:PEEandPSV2neocotransfectiongroup,normalchondrocytesweretakenasCgroup.Agroupwastheexperimentalgroup,B,Ctwogroupswerepositivecontrolgroupandnegativecontrolgroup.UsingrealtimePCRdetectionmiRNA-9inosteoarthritis(OA)transfectionefficiencybyannexinV-FITCdetectionoverexpressionmiRNA-9ofosteoarthritiscartilagecellapoptosiseffect,usingthemethodofMTTandALPobservedtheproliferationanddifferentiationofthetwogroupsofcells,WesternblotwasusedtodetectthetwogroupsofcellsofJagged1andNotch1proteinexpressionlevels.Results:Real-timePCRshowedthatexpressionofmiRNA-9inarthritiscellsinanormalcartilagecellswassignificantlyreduced(P=0.009).Successfulconstructionpre-miRNA-9eukaryoticexpressionvectorandrealtimePCRshowedpre-miRNA-9transfectionosteoarthritiscartilagecellsmiRNA-9expressionwassignificantlyincreased(P=0.003).V-FITCAnnexintestshowedthatmiRNA-9overexpressioncouldsignificantlyinhibittheapoptosisrateofosteoarthritiscells(P=0.03).BlotWesternassayshowedthatmiRNA-9overexpressioncouldsignificantlydownregulatetheexpressionlevelofJagged1andNotch1protein.Conclusion:overexpressionofmiRNA-9mayinhibitthedifferentiationofchondrocytesinosteoarthritisbydownregulatingtheexpressionofNotchpathway.【Keywords】Osteoarthritis;MiRNA-9;Notchpathway;Proliferationanddifferentiation背景引言：骨性关节炎是骨科常见病，目前对于骨性关节炎的发病机制仍尚不清楚[1-4]。Notch通路是调节软骨细胞向成骨细胞的增殖与分化的关键通路之一。据报道，激活Notch通路可促进软骨细胞向成骨细胞的增殖与分化。目前有研究发现微小RNA（miRNA）的异常调控与骨性关节炎的发生密切相关[5-8]。本研究通过构建miRNA-9的真核表达载体，探讨其在调控软骨细胞向成骨细胞的增殖与分化中的作用，并分析miRNA-9对Notch通路的调控作用。1.材料与方法1.1材料正常软骨细胞、关节炎软骨细胞和构建好的PEFMTSSS1表达载体、pSV2neo筛选质粒均购于美国Invitrogen公司,蛋白电泳仪,PCR仪等购自美国Bio-Rad公司RM2155型超薄石蜡切片机产自德国LEICA公司;AllegraTM64R台式低温高速离心机产自德国Beckman公司，小鼠抗人Jagged1，Notch1购自美国AssayBiotechnology公司。2.正常软骨细胞、关节炎软骨细胞的培育：正常软骨细胞、关节炎软骨细胞购自上海生物工程有限公司，将其置38℃,5%CO2细胞培养箱常规培养,等到细胞长满后,用0.3%的胰酶消化传代。1.2实验分组与质粒转染：将传代的关节炎软骨细胞分为两组:A组:PEFmiRNA-9和PSV2neo共转染组,B组:PEE和PSV2neo共转染组,取正常软骨细胞作为C组。A组为实验组,B,C两组为阳性对照组和阴性对照组。按照说明书进行转染,加入400μgPmlG419筛选,经3周后形成阳性克隆组,扩增培养,备用。1.3Real-timePCR检测miRNA-9在3组细胞中的表达和转染提取3组细胞的总RNA，用于检测miRNA-9在3组细胞中的表达差异。上游引物为5’-TGCGATCCAGTTGGTCGT-3’，下游引物为5’-CTTTTTGCTAGTTCGGTTACC-3’，U6作为内参。转录条件为：37℃15min，85℃5S。PCR扩增条件为95℃10min，1min预变性，95℃15S，60℃30S，72℃45S，重复40个循环，计算3组细胞中miRNA-9的表达量。1.4miRNA-9过表达对关节炎软骨细胞凋亡影响的检测采用流式细胞仪法，收集A，B组待测细胞，种于6孔板中，调整细胞密度至5×10细胞/ml，加入10μlAnexinⅤ混匀，室温暗处温育染色15min，在上机前5min加入10mg/LPI染液5μl。用FACS流式细胞仪进行双色荧光细胞流式计数，观察凋亡细胞百分比。1.5MTT检测miRNA-9过表达对关节炎软骨细胞增殖的影响12孔培养板接种两组关节炎软骨细胞，用含10%FBS的DMEM培养细胞24h，细胞贴壁后，每孔200μl加药培养基处理细胞，吸出培养基，每孔加200μl的MTT工作液，37℃孵育4h。吸出每孔中的MTT工作液，每孔加100μlDMSO，用VITOR3测490nm处的光吸收值。1.6ALP定量测定miRNA-9过表达对关节炎软骨细胞分化的影响12孔培养板接种细胞，分别于诱导3d、5d、7d、9d、11d各组取6孔，取上清100uL，按照试ALP剂盒说明书进行操作，记录结果，计算ALP活性。1.7Westernblot检测miRNA-9对Jagged1，Notch1蛋白水平的影响分别提取A，B组关节炎软骨细胞的总蛋白，用BCA试剂盒测定各组样本蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转至PVDF膜，丽春红染色验证后用含5%血清的TBST封闭，依次结合对应Jagged1和Notch1一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗，暗室曝光显像。1.8统计学方法应用SPSS18.0软件：计量资料采用方差分析。Western-blot和Real-timePCR结果采用χ2检验，P＜0.05差异有统计学意义。2.结果2.1miRNA-9表达载体构建结果Real-timePCR结果显示，miRNA-9在B组关节炎软骨细胞中的表达较C组正常软骨细胞明显下调(P=0.009)，A组关节炎软骨细胞miRNA-9的表达较C组明显上调(P=0.003)，证实表达载体已成功构建。2.2A，B两组关节炎软骨细胞体外培养的形态观察和凋亡率比较A，B组关节炎软骨细胞体外培养的形态观察，见图1。A组